猪链球菌2型VicRK双组份调控系统的功能研究

发布时间：2020-08-18 20:01

【摘要】：猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人兽共患病原菌,不仅会给养殖业造成巨大的经济损失,而且严重影响人类的公共安全。根据荚膜多糖抗原的差异可以分为29个血清型,其中2型(SS2)为危害最严重的血清型。首次报道的人感染猪链球菌病的国家为丹麦,后来在欧洲,北美洲,南美洲,大洋洲,亚洲等多个地区都有人感染SS2的报道。双组份调控系统是细菌感应外界变化并作出重要应答反应的一种系统,其对细菌的生长代谢和致病性发挥着重大的作用。YycG/YycF双组份系统最早发现于枯草芽孢杆菌中,后来由于其在细胞壁代谢中发挥着重要的作用被命名为WalK/WalR,在肺炎链球菌中被命名为VicK/VicR。有文献报道VicRK在一些细菌的链长、形态、生长、代谢、细胞壁稳态、生物被膜、细胞毒力等方面发挥着重要的作用,但是在猪链球菌中却没有相关的报道。本文主要对猪链球菌2型VicRK双组份系统进行研究,了解其作用机制。具体内容如下:1.猪链球菌2型vicK基因缺失突变株和互补菌株的构建及生物学特性在构建vicK/vicR缺失突变株的过程中发现vicR基因缺失致死,只构建了vicK基因缺失突变株。在ΔvicK突变株的基础上利用电转化的方法构建了互补菌株CΔvicK。通过革兰氏染色的方法研究了野生株WT、突变株ΔvicK、互补菌株CΔvicK在链长,形态等方面特点,结果显示三个菌株的链长,形态无明显的差异,说明vicK基因对SS2的链长和形态没有影响。通过在TSB加10%血清静止、摇动、加入0.5 mmol/L二酰胺、加入0.5 mmol/L过氧化氢、加入3 mmol/L百草枯以及不加血清等条件下测定三个菌株的生长曲线,结果显示除了不加血清的条件,突变株ΔvicK生长速率明显低于野生株和互补菌株,其他条件三个菌株生长没有明显差异,说明vicK基因除了在低营养条件下对SS2的生长有影响外在其他条件下并不对SS2造成影响。2.vicK基因对SS2致病性的影响对hBMEC(人脑微血管内皮细胞)黏附和Hep-2细胞(人喉癌上皮细胞)黏附、入侵实验中,发现vicK基因缺失突变株ΔvicK的黏附、入侵能力明显低于野生株和互补菌株。在人血全血杀菌实验中,发现突变株ΔvicK在全血中的存活能力明显低于野生株,说明vicK基因在SS2抵抗先天性免疫中发挥着重要的作用。在仔猪竞争感染实验中,发现突变株ΔvicK在各个器官中的定植能力明显低于野生株,说明vicK基因在SS2的毒力方面发挥着重要的作用。为了寻找VicRK双组份调控系统调控的毒力基因,我们做了RNA-seq实验,并验证了其数据的准确性,从RNA-seq数据中找到了9个可能受控制的毒力基因,并用EMSA(凝胶电泳实验)验证了这些毒力基因是受VicRK双组份调控系统调控的。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.611
【图文】：

载体,图谱

pSET4s载体图谱

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13图 3-2 pSET2 载体图谱图 3-3 pET30a 载体图谱Figure 3-2 The Map of pSET2 vector Figure 3-3 The Map of pET30a vector3.1.2 主要试剂PrimeSTAR 高保真 DNA 聚合酶及其 Buffer、各种限制性内切酶及其 Buffer、T4 DNA 连接酶及其 Buffer、DNA marker（DL2000、DL5000、DL15000）均购自宝生物工程(大连)有限公司。2×Taq Master Mix 酶购于诺唯赞公司。Protein

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