海带多糖和山柰酚对猪卵母细胞老化和早期胚胎发育的影响

发布时间：2020-08-18 20:03

【摘要】：猪卵母细胞和胚胎的体外培养技术被广泛用于研究胚胎发育的机制和动物生殖技术。氧化应激是影响卵母细胞质量和胚胎发育的重要因素,因此减少卵母细胞及胚胎中的氧化应激在研究胚胎发育的机制和动物生殖技术中有重要意义。本研究旨在探究两种抗氧化剂海带多糖(LAM),山柰酚(KAE)在猪卵母细胞老化和早期胚胎发育的影响。主要分为以下四个试验:试验一:LAM对猪老化卵母细胞的影响LAM是一种具有良好生物相容性的葡聚糖混合物,可作为食品添加剂和营养保健品使用,有提高生长性能和免疫应答的作用。本研究旨在探讨LAM对猪卵母细胞老化的影响。发现20μg/mLLAM延缓了卵母细胞老化过程,提高了老化卵母细胞的质量。体外老化过程中,在IVM中添加LAM增强了老化卵母细胞的后续发育能力。卵母细胞老化24小时后,LAM处理组相比老化组可以显著提高随后胚胎发育的囊胚率(P0.01),调节细胞凋亡相关基因Bax和Caspase-3的mRNA转录水平显著降低(P0.01)。与老化组相比,LAM处理组卵母细胞内活性氧含量显著降低(P0.01),谷胱甘肽含量显著升高(P0.01),线粒体膜电位显著升高(P0.01),Caspase-3和组织蛋白酶B活性显著降低(P0.01)。综上所述,这些结果表明LAM可以有效延缓猪卵母细胞老化,提高老化卵母细胞质量。试验二:LAM对猪胚胎发育的影响本研究旨在探讨LAM对猪早期胚胎发育的影响及其机制。结果表明,体外培养期间,在IVC中添加LAM后,猪早期胚胎的发育能力显著提高。体外培养期间20μg/mLLAM的处理组,与对照组相比,显著提高了胚胎的卵裂率(P0.01)、囊胚率(P0.01)、孵化率(P0.05)和囊胚内总细胞数(P0.01)。值得注意的是,LAM降低了 H202诱导的细胞内活性氧生成(P0.01)。同时LAM提高了细胞内谷胱甘肽水平和线粒体膜电位极性(P0.05)。此外,在猪胚胎早期发育阶段添加LAM后,合子基因组活化相关基因(Yap1)、多能性相关基因(Oct4、Nanog、Sox2)、孵化相关基因(Cox2、Gata4、Itga5)表达上调(P0.05)。这些结果表明,LAM通过降低猪早期胚胎内氧化应激水平进而促进胚胎发育。试验三:KAE对猪老化卵母细胞的影响KAE是最常见的膳食黄酮醇之一。存在于不同的植物物种中,具有抗炎、抗氧化和抗癌的治疗作用。本研究主要探究在IVM中添加KAE对老化猪卵母细胞的影响及其机制。结果表明,0.1μM KAE可维持老化卵母细胞的质量,增强老化卵母细胞的发育潜能,延缓卵母细胞老化。老化24小时的卵母细胞发育成囊胚后,KAE处理组相比老化未处理组囊胚率显著提高(P0.05)。并且KAE处理组卵母细胞发育成囊胚后,囊胚中的胚胎多能性相关基因、Oct4、Nanog、Itga5的mRNA转录水平显著升高(P0.05)。KAE处理后的老化卵母细胞相比老化未处理的卵母细胞显著增加了线粒体膜电位极性(P0.05),降低细胞内凋亡指数(P0.05)和活性氧含量(P0.05)。因此本研究结果表明,KAE可以通过降低氧化应激和改善线粒体功能来延缓猪卵母细胞的老化。试验四:KAE对猪胚胎发育的影响本研究探讨了在IVC中添加KAE对猪早期胚胎体外损伤的影响。在IVC中添加不同浓度的KAE,探究KAE对胚胎发育的影响。结果表明,添加0.1μMKAE显著提高囊胚率(P0.05),并且0.11μM KAE可以缓解200μM H2O2处理后的胚胎质量下降和囊胚率降低(P0.05)。KAE缓解了H2O2诱导的线粒体膜电位极性降低和活性氧的生成(P0.05)。此外,与对照组相比,H2O2诱导的氧化损伤组通过添加KAE可以减少囊胚内自噬水平(P0.05)和DNA损伤的程度(P0.05)。这些结果表明,KAE通过降低氧化应激和增强线粒体功能,对猪孤雌胚胎的发育有一定的促进作用。综上所示,本研究表明LAM可以有效延缓卵母细胞老化,增强老化卵母细胞发育潜能,提高猪胚胎的体外发育率;KAE可以维持老化卵母细胞质量,延缓卵母细胞老化,有效缓解H2O2引起的早期胚胎的氧化损伤,对猪胚胎发育起到促进的作用。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S828
【图文】：

胚胎发育,母细胞,卵母细胞,成囊

为了确定ＬＡＭ是否能提高老化卵母细胞囊胚率和囊胚质量，对成熟卵逡逑母细胞进行孤雌激活。通过剂量试验研究，选择囊胚率最高的ＬＡＭ剂量，逡逑作为最佳ＬＡＭ浓度。最终浓度为２０邋ｐｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ，并用于后续研宄（图２．１．Ａ）。逡逑孤雌激活后，对照组卵母细胞（体外培养不需额外培养２４小时）囊胚率为逡逑５６．７３±１．２３％。而老化２４小时卵母细胞囊胚率仅为２８．６８±邋１．９７％。但是添逡逑加２０邋ｎｇ／ｍｌ邋ＬＡＭ后老化２４小时的卵母细胞囊胚率为４５．３３±２．０５％，相比老逡逑化未添加ＬＡＭ组囊胚率显著增加（Ｐ＜邋０．０１）。逡逑探究ＬＡＭ对老化卵母细胞发育的影响，统计了新鲜和老化卵母细胞发逡逑育的囊胚内细胞总数（图２．１．Ｂ和Ｃ）。老化２４小时后的卵母细胞发育成囊胚逡逑后细胞总数显著低于新鲜卵母细胞发育成囊胚后的细胞总数。老化后的卵逡逑母细胞中，ＬＡＭ处理组相比老化组显著增加了囊胚内总细胞数。为了进一逡逑步确定ＬＡＭ对凋亡相关基因表达的影响，测量了各组囊胚中Ｃａｓｐａｓｅ－３、逡逑Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２基因的ｍＲＮＡ表达水平（图２．１．邋Ｄ）。老化卵母细胞发育成囊胚后逡逑Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ的表达水平显著高于新鲜卵母细胞组。然而，ＬＡＭ处理组逡逑降低了老化卵母细胞发育成囊胚后Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ基因的表达（Ｆ＜邋０．０１）。逡逑在老化后的卵母细胞中，ＬＡＭ处理组的卵母细胞与未处理组相比，Ｂｃｌ－２逡逑转录水平无显著差异（尸＞邋０．０５）。逡逑１５逡逑

卵母细胞,组织蛋白酶

逡逑图２．４邋ＬＡＭ对老化卵母细胞组织蛋白酶Ｂ活性的影响。（Ａ）具有代表性的图像显示逡逑组织蛋白酶Ｂ在卵母细胞中的活性，标尺：１０0Ｐｍ。（Ｂ）相对定量检测卵母细胞组织逡逑蛋白酶Ｂ的荧光强度显，Ｒ邋＝邋３。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．２．４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＡＭ邋ｏｎ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ａｇｅｄ邋ｏｏｃｙｔｅｓ．邋（Ａ）逡逑Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｉｎ邋ｆｒｅｓｈ，邋ａｇｅｄ，邋ａｎｄ邋ＬＡＭ－ｔｒｅａｔｅｄ邋Ｍｉｌ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒ：邋１００邋｜ｉｍ．邋（Ｂ）邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｆｏｒ邋ｃａｔｈｅｐｓｉｎ邋Ｂ邋ｉｎ逡逑ｏｏｃｙｔｅｓ．邋Ｒ＝３．逡逑Ａ逡逑Ｆｒｅｓｈ逦Ａｇｅｄ逦Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑煖幽逡逑Ｂ逡逑ｋ邋２．５－，逡逑！邋２．０－逦Ａ逡逑Ｃ逡逑名‘邋１＞逦－１－逦？逡逑ｃ逡逑１．０－逡逑Ｓ邋０．５邋■丨■ｊＵｐ１逡逑三邋0．0邋Ｊ＿＾逦邋－邋．ｊ逦邋一；一．「：．一ｓ逡逑ｒｊｍ逦Ｆｒｅｓｈ逦Ａｇｅｄ邋Ａｇｅｄ＋ＬＡＭ逡逑图２．５邋ＬＡＭ对老化卵母细胞ｃａｓｐａｓｅ－３活性的影响。（Ａ）表示卵母细胞中ｃａｓｐａｓｅ－３逡逑活性

孤雌胚,囊胚孵化,处理组,对照组

３．２．１邋ＩＶＣ期间添加ＬＡＭ对猪早期胚胎发育能力的影响逡逑在ＩＶＣ培养基中添加２０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＬＡＭ，检测ＬＡＭ对孤雌激活胚胎发育逡逑的影响。如图３．１所示，ＬＡＭ处理组相比对照组显著提高了卵裂率（７９．９３逡逑±１．１６％ｖｓ８７．５１±０．７４％，Ｐ＜０．０１）。ＬＡＭ处理组相比对照组显著提高了逡逑第五天囊胚率２邋（８．８７邋±１．９９％邋ｖｓ邋３５．３１邋±１．８１％，尸＜０．０１），第六天囊胚逡逑率（３６．８８邋±邋２．８７％邋ｖｓ邋４７．９１邋±邋４．５７％，尸邋＜邋０．０１邋）和第七天囊胚率（４３．５３邋±邋１．３３％逡逑ｖｓ邋５６．０４邋±３．９９％，尸＜０．０１）。ＬＡＭ处理组与对照组相比第五天囊胚的孵逡逑化率无显著差异（２．８５±３．２５％ｖｓ６．８８±２．４９，尸＞０．０５），但是ＬＡＭ处理逡逑组相比对照组显著提高了第六天囊胚孵化率（８．８３邋±邋２．７２％邋ｖｓ邋２２．５３邋±邋１．８０，逡逑尸邋＜０．０１）和第七天囊胚孵化率（２１．４１邋±４．４１％邋ｖｓ邋３３．６３邋±４．１９％，尸＜邋０．０５）。逡逑结果显示

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