真皮间充质干细胞和心脏间充质干细胞的培养及生物学特性研究

发布时间：2020-08-19 15:10

【摘要】：畜禽种质资源是维持生态安全、农业稳定的重要资源,它推动着经济的繁荣与社会的进步。重要的家养动物种质资源应该受到重视,并得到有效的保护。间充质干细胞可以在体外快速增殖并且可以向其他细胞分化。这些优点使得它们成为畜禽种质资源保存研究的新渠道。本实验以肉鸡真皮来源和鹅心脏来源的间充质干细胞为实验对象,在体外对细胞进行了分离培养、生物学特性研究和诱导分化研究,并得到以下结果:1.利用胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶分离得到肉鸡真皮间充质干细胞(Dermal Mesenchymal Stem Cells,DMSCs),并在体外条件下培养31代,细胞形态主要为长梭形。RT-PCR鉴定结果显示,细胞表达CD73、CD29、CD44,和CD71基因。免疫组织化学方法检测结果显示肉鸡DMSCs阳性表达CD105、CD90、CD73和CD44表面标记物。通过流式细胞仪分析,CD29、CD44和CD73在肉鸡DMSCs中高表达。DMSCs的生长曲线为明显的“S"形,与细胞在体外增殖的通常规律基本吻合。DMSCs的群体倍增时间和克隆形成能力的结果表明细胞的增殖能力随着代次的升高而减弱。研究表明肉鸡DMSCs能够在一定的条件下被分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞,通过特异性染色和RT-PCR鉴定证明肉鸡DMSCs向这三种细胞成功分化。2.利用胶原酶II和胰蛋白酶分离得到鹅心脏间充质干细胞(Heart-derived Mesenchymal Stem Cells,HMSCs),并在体外培养21代,细胞形态特征呈现梭状。RT-PCR和免疫组化检测检测结果都显示细胞表达CD29,CD34,CD73,CD166和CD44等MSCs特异基因。通过流式细胞术分析,CD29,CD34,CD73,CD166和CD44在鹅HMSCs中高表达。HMSCs的生长曲线表明HMSCs经过短暂潜伏期,进入迅速增殖的对数期,而后进入稳定期和衰亡期,呈现出明显的“S"形,与细胞体外生长的基本规律吻合。群体倍增时间结果表明HMSCs的增殖能力随着代次的升高逐渐减弱。通过在培养基中加入适当的诱导因子对HMSCs进行体外诱导分化实验,通过特异性染色和RT-PCR等方法对实验结果进行检测。实验结果表明,HMSCs成功被分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞,说明鹅HMSCs可以向多个方向诱导。综上所述,本实验成功分离培养了肉鸡DMSCs和鹅HMSCs,并且对它们进行了生物学特性研究和诱导分化研究。结果显示,肉鸡DMSCs和鹅HMSCs均表现出MSCs特有的生物学特性。实验结果对畜禽种质资源保存具有重要的意义,并且为再生医学和组织工程学提供了实验依据。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q813;S813
【图文】：

肉鸡,杂细胞,细胞,细胞的

加入阿利新蓝染色观察钙结节的形成情况。同时提取两组细胞的总 RNA-PCR 对 ACAN 这种特定基因进行检测。特定基因引物序列见表 2.3。。阿利新蓝染色：舍去原培养基，PBS 清洗 3 遍。舍去 PBS，加入 1mL 4 %多聚甲醛，固弃去固定液，PBS 清洗 3 次。舍去 PBS，加 2 mL 茜素红染色液，室温作用 30min。弃清洗 3 次。观察细胞的染色情况，并拍照记录。结果与分析肉鸡 DMSCs 的分离培养.1 肉鸡 DMSCs 的形态特征DMSCs 接种到 60 mm 培养皿中 24 h 之后，细胞成簇生长，折光性强，细胞生命力旺盛胞的形态大多数呈梭状或多角形。长有细胞的地方，细胞密度较大，连接较为紧密。没细胞的地方，细胞延展较好，形态较好观察。培养皿中会混有死细胞和杂细胞，图中发即为死细胞或未贴壁杂细胞。细胞数量符合传代标准，遂进行传代（图 2.1A）。此时度不再过分紧凑，细胞易于观察。形态也趋于均一，大多数为长梭形。仍有少数杂细胞亡的细胞。当 DMSCs 密度达到 80% ～ 90%时，进行细胞传代（图 2.1 B）。

编码序列,表面标记,肉鸡,冻存

Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively鸡 DMSCs 的冻存情况MSCs 进行传代培养的同时，也对细胞进行保存，按每冻存管 1×104个细胞进行冻存数量统计情况如表 2.4 所示。表 2.4 细胞冻存统计Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 总计数量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 48鸡 DMSCs 的生物学特性鸡 DMSCs 的 RT-PCR 检测测肉鸡 DMSCs 表面标记物。从 NCBI 系统中检索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73这些基因的编码序列，并使用 primer5.0 进行特异性引物设计。RT-PCR 检测结果表MSCs 表达 CD29, CD44, CD71 和 CD73 这些 MSCs 特异基因, Marker 为 DNA Ma)。

细胞形态,肉鸡,冻存,表面标记物

图 2.2 DMSCs 不同代次的细胞形态(40x)Fig.2.2 The cell morphology of DMSCs in different generations (40x)分别是 DMSCs P0 到 P31 代细胞形态Cellular morphology of DMSCs of P0-P31, respectively2.2.1.2 肉鸡 DMSCs 的冻存情况对 DMSCs 进行传代培养的同时，也对细胞进行保存，按每冻存管 1×104个细胞进行冻存，DMSCs 保存数量统计情况如表 2.4 所示。表 2.4 细胞冻存统计Table 2.4 Cellμlar cryopreservation代次 P3 P7 P9 P10 P13 P16 P19 P23 P25 P28 总计数量(管) 7 3 7 4 5 3 7 5 3 4 482.2.2 肉鸡 DMSCs 的生物学特性2.2.2.1 肉鸡 DMSCs 的 RT-PCR 检测检测肉鸡 DMSCs 表面标记物。从 NCBI 系统中检索了 GAPDH，CD29, CD44, CD73 和

【参考文献】