坦布苏病毒感染对鸭胚成纤维细胞生物学功能的影响及其机制研究

发布时间：2020-08-19 16:42

【摘要】：坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)感染,是于2010年4月份发生在我国江浙地区的一种新发病毒性传染病,其主要引起产蛋鸭体温升高、食欲下降、卵泡变性出血、卵黄性腹膜炎、产蛋大幅下降以及雏鸭头颈震颤、共济失调和四肢麻痹等典型症状。该传染病具有传播范围广、传播速度快以及感染率高等特点。至今,已造成我国大多数省份的养鸭场发生感染,严重影响着我国水禽养殖业的健康发展。深入探究病毒感染所诱导宿主细胞的生物学功能改变及有关信号通路网络的调控机制,不仅有助于理解病毒在细胞内、外的信号传递,以及转录后的调节过程,自身与其他信号分子之间的关系及相互作用,还可对宿主细胞代谢及相关疫病的发生发展过程有较为全面的认识。然而,目前对于TMUV与其宿主细胞互作机制的研究甚少,对于该病毒所诱导宿主细胞生物学功能影响机制更是缺乏了解。为解决上述问题,本研究以鸭胚成纤维细胞(DEF)为研究对象,利用在流行病学调查中所分离的蚊源TMUV(TMUV-SDMS)作为国内该病毒优势株的代表株,运用转录组测序技术(RNA-Seq)、qRT-PCR和RNAi等分子生物学技术,在细胞及分子水平上深入探究TMUV感染对DEF细胞生物学功能的影响,筛选并验证该病毒感染与宿主细胞互作的关键基因或蛋白,探讨了TMUV-SDMS所诱导DEF凋亡与坏死的致死机理,为阐明该病毒逃逸宿主防御机制、探寻抗病毒新靶点等提供数据支持。研究内容主要分为以下五个方面:一、TMUV遗传演化分析本项研究在流行病学调查中所分离到的11株TMUV分离株(包括鸭源、鸡源、鹅源、麻雀源和蚊源)的基础上,对NCBI数据库67株TMUV代表株的同源性比对、进化树分析、蛋白质三级结构和糖基化位点进行了分析。结果表明:当前我国已有17个省份出现了TMUV的感染,且该传染病的爆发具有秋季高发的季节性特点;由以上78株病毒代表株的同源性比对和进化树分析可知,该病毒NS1基因的核酸和氨基酸的同源性均明显低于其E基因、NS3基因和NS5基因的核酸和氨基酸的同源性,TMUV主要演化为马来西亚(1955)、马来西亚(2012)、泰国(2013)和中国分离株I和中国分类株II(TMUV优势株)五大分支;根据以上病毒代表株蛋白质高级结构和糖基化位点分析,该病毒E蛋白在148~151处氨基酸位点存在着由无规则卷曲到α螺旋的变异,在380~381处和393~397处存在着β折叠片段的延长的变异,在154处氨基酸糖基化位点存在着由NYSA到NYPV、NYSV和NYPA的突变;此外,该病毒NS1蛋白在180~182处氨基酸位点存在着由无规则卷曲到α螺旋的结构变异,在175处氨基酸糖基化位点存在由NTTD到NITD的突变。以上结果表明,当前我国TMUV优势株为中国分离株II,且总体变异程度较小;蚊源TMUV(TMUV-SDMS)可作为国内TMUV优势株的代表株。二、TMUV-SDMS在DEF中的感染及样品RNA-Seq分析本研究选用最早感染TMUV蚊源细胞(C6/36)对TMUV-SDMS进行增殖培养,随后将增殖培养后的TMUV-SDMS接种至生长密度为70%~80%的原代DEF中。将感染该病毒的DEF细胞和未感染该病毒的DEF细胞分别设为试验组和对照组,于感染后的12 h和24 h时分别提取总RNA,并对其进行质检(A260/A2801.5,A260/A2301.0,RIN7)。运用Illumina HiSeq 2000~(TM)平台对以上样品进行转录组测序(RNA-Seq),采用RPKM(Reads Per Kilobase of exon model per million mapped sequence reads)方法对Unigene进行计算,按照表达量倍数变化(Fold Change)和表达量变化显著性(P value)筛选Unique(差异基因的筛选标准为差异倍数Fold change2且P0.05)。最后,在全基因组背景下,运用超几何运算将筛选出差异表达基因分别向GO功能分类和KEGG信号通路富集分析。结果显示,经过质控后的各组样品得到的clean data,Q20和Q30质控率均在94.0%以上,由此表明本研究中所获得的转录组测序数据质量较高。在病毒感染12 h时,共筛选出911个差异基因,其中83.96%(764/911)的差异基因上调表达,16.04%的差异基因下调表达(147/911);在病毒感染24 h时,共筛选出3008个差异基因,其中59.54%(1791/3008)的差异基因上调表达,40.46%的差异基因下调表达(1217/3008)。通过对以上差异基因进行GO功能分类和KEGG信号通路富集分析可知,这些差异基因行使的生物学功能主要为免疫系统、细胞生长与坏死、信号转导和信号分子与交互等方面。以上结果表明,TMUV-SDMS可诱导DEF免疫系统、细胞生长与坏死、信号转导和信号分子与交互等生物学功能的改变。三、TMUV-SDMS感染对DEF免疫系统的影响在本研究中,由RNA-Seq所提示的信息可知,免疫相关的差异基因主要富集在Toll样受体信号通路、RIG-I-样受体信号通路、趋化因子信号通路、NOD样受体信号通路、造血细胞系、细胞质DNA识别信号通路等。通过对以上信号通路中的差异基因按照表达量的高低进行进一步分类汇总可知,在TMUV-SDMS感染DEF早期和中期时,宿主细胞内与免疫相关信号通路中的模式识别受体(如RIG-I、MDA5和TMEM173)被激活,导致细胞因子(如IFNα、IL-6、IL-12、CCL19和CCL20),转录因子和信号分子(如IRF7、NF-kB和STAT1)和抗原呈递蛋白(如CD44和CD70)的大量产生,由此初步揭示了宿主细胞应对该病毒感染的天然免疫转录谱。四、TMUV-SDMS感染对DEF细胞凋亡与坏死影响结合RNA-Seq所提供的信息,本研究运用激光共聚焦显微镜、流式细胞术和JC-1探针等技术定性和定量检测了TMUV-SDMS感染对DEF细胞生长与坏死的影响。结果显示,TMUV-SDMS感染不仅可以导致DEF细胞在感染12 h和24 h后的细胞活性显著降低(P0.01),还可以诱导DEF细胞显著的凋亡与坏死、S+G2M期的停滞以及线粒体膜电位的降低(P0.05或P0.01)。通过对本研究中细胞凋亡与坏死相关差异基因的汇总分析可知,这些差异基因主要定位于内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径。以上结果表明,TMUV-SDMS感染可诱导DEF细胞S+G2/M期停滞,这可能是因CDC20B过表达所致;且该病毒感染主要是通过内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径诱导DEF凋亡与坏死。五、DEF细胞生长与坏死关键基因的筛选与验证为了进一步确定TMUV-SDMS与DEF互作的关键基因,阐明其在调节该病毒感染所诱导DEF细胞生长与坏死过程中所行使生物学功能。本项研究根据RNA-Seq所提供的信息,选择在细胞凋亡信号通路中表达量最高且具有调节线粒体膜通透性、控制CytC和凋亡因子释放等作用的B淋巴细胞瘤2A1抗凋亡基因(BCL2A1)作为目的基因,运用RNAi等分子生物学技术探究其在调节细胞周期、细胞凋亡与坏死等细胞生长与坏死过程中的调节作用。研究结果表明,BCL2A1具有调控宿主细胞G2M期以及细胞凋亡和坏死作用;且该靶基因与BCL2、CDC20B和MCL1等还具有密切关系(即:与BCL2有拮抗作用,与CDC20B、CytC和MCL1等有协同关系),但具体作用机制还需今后进一步探究。本研究从分子水平探讨了TMUV感染对DEF细胞生物学功能的影响,深入揭示了该病毒所诱导DEF凋亡与坏死的具体机制,研究结果对于丰富TMUV感染宿主转录谱、阐明该病毒逃逸宿主防御机制和探寻靶向线粒体抗病毒药物研发等均具有重要意义。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.32
【图文】：

黄病毒,结构示意图

2013）。该属中的大多数黄病毒可按照血清学的方法分为 8 个的深入，发现也有部分黄病毒（如 YFV 等）无法根据血清学进行分型（，这可能是由于该病毒分布广泛、宿主种类繁多等因素所导致。另径的不同，黄病毒属的病毒可分为蜱媒病毒（Tick-borne viruses groosquito-borne viruses group）和未知媒介病毒类（Non-vector group）。病毒的形态结构具有典型的黄病毒形态特征：电镜下，病毒为球形颗粒（直径约为 45为对称二十面体结构的核衣壳蛋白（直径约为 30 nm），为病毒基因 RNA；外层为脂质囊膜包裹，且有糖蛋白组成的刺突（图 1）（Heinz an

省份,样品,遗传演化

件中 Pearson’s 模块对 RNA-Seq 与 qPCR 部分差异基因的表达量进行的相关性验证；显著差异性水平为 p < 0.05（*）和 p < 0.01（**）；作图软件使用 GraphPad Prism 7 和 AdobeIllustrator CS6 等。3 结果及分析3.1 TMUV 遗传演化分析3.1.1 TMUV 流行病学调查在本研究中，我们在全国 17 个省份收集到 308 份疑似 TMUV 感染的病料，通过常规 RT-PCR 检测和 Sanger 测序验证，得到 212 份该病毒感染的阳性样品（图 3）。该疫病在全国的流行分布如图 3 所示，该病毒已由最初东南沿海地区蔓延至四川、重庆、湖北、内蒙古等内陆地区，现已造成我国 50 %的省市自治区（17/34）的养禽场发生感染。值得注意的是，该疫病的爆发呈现季节性规律，在秋季较为高发（图 4）。

发病情况,马来西亚,化分,泰国

图 4 TMUV 感染病例在一年四季的发病情况Figure 4 TMUV infection positive cases in four seasons化分析亚和我国大陆 78 株 TMUV 代表株的开放阅读框（ORF）、因和 NS5 基因进行进化树分析可知（图 5，图 6，图 7，图主要分为马来西亚（1955）、马来西亚（2012）、泰国（20分类株 II（TMUV 优势株）五大分支，且本研究所分离到的国分离株 II（TMUV 优势株）。

【参考文献】