IBV感染CEK细胞自噬和凋亡的发生及其对病毒复制的影响

发布时间：2020-08-19 19:22

【摘要】：鸡传染性支气管炎(IB)是由禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV M41株是IBV标准毒力株。鸡胚肾(CEK)细胞来源于IBV易感宿主,能较好模拟IBV感染环境且同时具有较高的敏感性。CEK细胞作为一种宿主细胞模型,已经广泛地被应用于研究IBV致病机制。细胞自噬和细胞凋亡是各类生物体内十分重要的生物学过程,两者均积极地参与机体的发育和生长等过程。一直以来都有研究专注于病毒感染过程中自噬与凋亡所扮演的特殊角色。然而针对于IBV来讲,自噬与凋亡的发生及其在病毒复制过程中起到何种关键作用至今未有系统性的深入研究。本试验首先研究了IBV感染CEK细胞后是否发生自噬和凋亡,利用Western Blot、免疫荧光技术、实时荧光定量PCR和电镜等方法进行相关检测。结果表明,IBV感染CEK细胞后0-48 h内发生自噬和凋亡,自噬先升高后下降(30 h为转折点),凋亡从30 h开始发生且持续升高,自噬和凋亡的发生有着一定的规律。Western Blot和病毒滴度试验检测自噬对病毒复制影响的结果显示,在0-48 h之内激活自噬,病毒复制先增加后减少;抑制自噬的情况下,病毒复制先减少后增加,表明自噬先促进病毒复制后抑制病毒复制。凋亡对病毒复制影响的结果显示,在30-48 h之内激活凋亡的情况下,病毒复制减少;抑制凋亡的情况下,病毒复制增加,表明凋亡抑制病毒复制。为了进一步研究自噬和凋亡是否相互作用从而影响病毒的复制,利用Western Blot和实时荧光定量PCR方法等进行相关检测。结果显示,在病毒感染30 h和36 h,激活自噬的情况下,凋亡增加,抑制自噬的情况下,凋亡减少;而激活或抑制凋亡的情况下,自噬基本无变化。而42 h和48 h处,激活凋亡的情况下,自噬减少,抑制凋亡的情况下,自噬增加;而激活或抑制自噬的情况下,凋亡基本无变化。表明自噬先主导促进凋亡,凋亡后主导抑制自噬;并且先是自噬对病毒复制的抑制作用强于凋亡,后来是凋亡对病毒复制的抑制作用强于自噬。综上所述,IBV感染CEK细胞发生自噬和凋亡,自噬先促进病毒复制后抑制病毒复制,凋亡抑制病毒复制。并且自噬先主导促进凋亡从而抑制病毒复制,凋亡后主导抑制自噬也抑制病毒复制。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31
【图文】：

结 果 结果.1 IBV M41 株感染 CEK 细胞的建模.1.1 IBV M41 株感染 CEK 细胞用 100 倍 TCID50的 IBV（在 CEK 细胞上稳定传至第十代）感染 CEK 细胞后，在倒置镜下观察。结果如图 3-1 所示，实验组中 IBV 感染 CEK 细胞后，呈现出细胞由原本的不规则船帆形状逐渐变圆、固缩、聚集成团、最后脱落。细胞对照组并无此变化。由此 IBV 可在 CEK 细胞上稳定传代，并发生典型的 CPE。

DNA 2000 Marker；2：IBV-NA 2000 Marker; 2: IBV-N; 感染 CEK 细胞的 RT-PR assay results of IBV-in病毒于 CEK 细胞 72 h 后计算病毒感染复数（M0 MOI 的 IBV 分别接种以观察 IBV N 蛋白的表山羊抗兔 IgG，1：250表达量均显著高于 0.1

选取0.1 MOI、1 MOI和10 MOI的IBV分别接种于CEK细胞于24 h后进行间接免疫荧光（IFA）实验，以观察病毒特异性荧光的表达情况。一抗选取IBV全病毒多抗，1：250倍稀释；二抗选取FITC标记山羊抗兔IgG，1：2000倍稀释。结果如图3-4所示，1 MOI下的病毒特异性荧光最多最亮，显著多于0.1 MOI和10 MOI，10 MOI可能由于病毒接种量太大导致部分细胞已经脱落死亡。综合Western Blot和IFA的结果，后续实验我们选取1 MOI进行病毒接种最为恰当。a24 h36 h0.1 MOI1.0 MOI10 MOI0.1 MOI1.0 MOI10 MOIIBV Nβ-actinb

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本文编号：2797482