PEDV感染Vero细胞的蛋白质组学分析及诱导细胞自噬的机制研究

发布时间：2020-08-20 09:23

【摘要】：近年来,由猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株导致的猪流行性腹泻(PED)大规模暴发,给世界养猪业造成了巨大经济损失,引起各国学者的高度重视。PEDV快速检测及其致病机理的研究就显得尤为重要。本研究首先制备了PEDV单克隆抗体,建立了肠道组织PEDV快速检测方法,为临床PED诊断以及致病机制研究提供基础。开展了以i TRAQ为基础的PEDV强弱毒株感染Vero细胞的比较蛋白质组学分析,获得PEDV强弱毒株感染Vero细胞的差异蛋白表达谱,为解析不同毒力PEDV毒株的致病机制提供参考。在蛋白质组学分析的基础上,探究了细胞自噬在PEDV复制过程中的作用,为新型抗病毒策略的制定提供基础。具体研究内容如下:1.PEDV单克隆抗体的制备及生物学特性分析利用原核表达的PEDV S1D蛋白,制备了3株抗PEDV的单克隆抗体。三株单抗效价均在1:10~6以上,且均为Ig G 2a亚型κ轻链。IFA和Western Blot试验表明,该抗体可以与杆状病毒表达的S1蛋白发生特异性反应,能够特异性识别PEDV病毒粒子,与另外两种常见肠道病毒TGEV、RV不发生交叉反应。此外,该单抗还可以用于PEDV感染仔猪肠道免疫组织化学分析。2.PEDV快速检测方法的建立在本试验获得单克隆抗体的基础上,借助冰冻切片技术,建立了一种用于临床肠道样品PEDV快速检测的IFA方法。该方法与HE染色分析相结合,不仅可以特异性检测肠道PEDV感染,还可以直观病变部位损伤情况。将102份临床送检仔猪肠道分别进行IFA和RT-PCR检测,两者PEDV检出率分别为97%和92%,总符合率为91.2%,表明该方法可以用于临床PEDV快速检测。3.PEDV强弱毒株感染Vero细胞的蛋白质组学分析本研究运用i TRAQ串联LC-MS/MS技术,开展了PEDV强弱毒株感染Vero细胞的蛋白质组学研究。在PEDV强毒株CH/YNKM-8/2013和CV777样疫苗毒株AH-M感染组分别鉴定到661个和474个差异表达的蛋白。生物信息学分析发现,差异蛋白主要聚焦于蛋白质合成、免疫调控、细胞组装、信号转导以及凋亡等方面。进一步分析发现,较弱毒株而言,PEDV强毒株显著上调NF-κB通路,诱发更强烈的炎症反应。此外,PEDV强毒株通过下调m TOR及其下游靶分子4EBP1和p70S6K,以及e IF2(真核起始因子)通路活性来抑制细胞蛋白质的合成。4.PEDV感染Vero细胞诱导完全细胞自噬PEDV感染Vero细胞蛋白质组学分析发现,多个自噬相关蛋白在PEDV感染过程中显著上调,同时自噬相关通路m TOR显著下调,这提示细胞自噬可能与PEDV在Vero细胞上的增殖有关。透射电子显微镜(TEM)观察发现,PEDV感染的Vero细胞中自噬样双层膜囊泡结构增多。激光共聚焦显微镜分析表明,PEDV感染导致GFP-LC3的点状积累,同时免疫印迹分析发现自噬相关标志蛋白表达量显著增加。这表明PEDV感染可以诱导细胞自噬。UV灭活试验进一步证明细胞自噬的激活与PEDV的有效复制有关。为了探究PEDV感染能否诱导自噬潮,我们检测了p62的降解、m RFP-GFP-LC3的共定位,以及加入溶酶体抑制剂后p62和LC3 II含量的变化,结果表明PEDV感染可以诱导完全细胞自噬。5.细胞自噬促进PEDV增殖为了探究细胞自噬在PEDV增殖过程中的具体作用,我们分别利用自噬抑制剂(3-MA或CQ)和诱导剂(rapamycin)处理Vero细胞,观察PEDV的增殖情况。发现抑制细胞自噬后,PEDV的病毒滴度降低,而诱导细胞自噬后,PEDV病毒滴度升高。将自噬关键基因Beclin1和ATG5沉默之后,PEDV病毒滴度降低。这进一步说明细胞自噬可以促进PEDV增殖。6.细胞自噬与NF-κB信号通路介导的炎症反应存在正调控关系为了探究细胞自噬在PEDV介导炎症反应中的作用,我们发现当自噬关键基因ATG5和Beclin1沉默之后,PEDV诱导的炎性细胞因子表达显著下调。这提示,细胞自噬可能参与PEDV介导的炎症反应。进一步研究发现,当细胞自噬受到抑制时,NF-κB信号通路活性降低。同样地,当NF-κB活性受到抑制时,PEDV诱导LC3 II的含量也显著降低。这表明细胞自噬可能与PEDV诱导的NF-κB信号通路存在正调控关系。为了排除上述过程中PEDV不同增殖滴度对炎性细胞因子表达的影响,我们用TNF-α处理自噬抑制后的Vero细胞,发现TNF-α介导的炎性细胞因子表达量下调。这进一步说明了PEDV感染Vero细胞诱导的细胞自噬与PEDV诱导的炎症反应存在正调控关系。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65
【图文】：

模式图,基因组结构,模式图,基因组

病毒粒子呈皇冠状，因此称为冠状病毒。PEDV 在 4℃、pH5.0~9.0 条件下，或者 37℃、pH6.5~7.5 条件下都能稳定存活，但 PEDV 对外界环境的抵抗力并不强，60℃的环境中，30 min 以上病毒就会失去感染活力。本病毒对乙醚和氯仿等有机溶剂敏感，酸性或碱性的杀毒剂也可以很快杀死病毒，与其他 α-冠状病毒一样，PEDV 没有凝血活性（Song and Park 2012）。1.1.5 PEDV 基因结构PEDV 是有囊膜的、线性、单股正链 RNA 病毒（Song and Park 2012），基因组全长约 28kb。PEDV 基因组结构如图 1-1 所示，在 5 帽子结构与 3 poly A 尾巴之间，基因组 RNA 包含 7 个开放阅读框（open reading frames，ORFs）（Kocherhanset al 2001）。最大的两个 ORFs（ORF1a 和 ORF1b）位于 5’ UTR 下游 2/3 基因组，编码病毒复制相关聚合酶类。另外 1/3 基因组编码 4 个结构蛋白（S、E、M、N）和 1 个非结构蛋白（ORF3）（Duarte et al 1993）。

技术流程,获得性免疫

华中农业大学 2017 届博士研究生学位（毕业）论文弱毒株感染组分别鉴定到 269 和 301 个差异表达的蛋白（Li et al 2016b）。运用iTRAQ 技术，Huang 等发现调节型 T 细胞（Treg）诱导的巨噬细胞蛋白表达发生显著变化，为阐述 Treg 细胞在获得性免疫反应中的作用提供了新的视角（Huang et al2010）。

技术流程,试剂

iTRAQ试剂结构

【参考文献】