家兔须毛癣菌型皮肤真菌病相关蛋白编码基因和lncRNAs的筛选及功能验证

发布时间：2020-08-20 11:10

【摘要】：家兔皮肤真菌病是养兔生产中的一种常见疾病,该病主要由丝状真菌侵入家兔皮肤角质层及其附属物(如兔毛,指甲)所引起。须毛癣菌是该病的主要致病菌,它可通过分泌枯草杆菌蛋白酶和金属蛋白酶来入侵宿主富含角蛋白的结构。目前家兔应答皮肤真菌感染的机制尚不清楚,因此本研究拟用RNA-seq技术从转录组水平鉴定与家兔皮肤真菌病形成相关的蛋白编码基因和lncRNAs,并在细胞层面探讨部分候选蛋白编码基因在家兔皮肤真菌病发病过程中的功能。本研究首先用须毛癣菌感染天府黑兔母兔背部皮肤,构建家兔皮肤真菌病模型;接着,利用RNA-seq技术和生物信息学技术对与家兔皮肤真菌病形成相关的蛋白编码基因和lncRNAs进行了分选鉴定及功能分析;最后,用β-glucan模拟真菌抗原感染家兔表皮角化细胞(keratinocytes,KC)以构建家兔KC炎症细胞模型,并利用RNAi技术和过表达技术分析JAK2-STAT3信号通路在β-glucan诱导的家兔KC炎症细胞模型中对CXCL8、CXCL11和IL-1β分泌的影响。本研究的主要结果如下:(1)用1.0×10~6 CFU/mL浓度的须毛癣菌感染家兔背部皮肤后发现,感染后的家兔皮肤表现出明显的发红、结痂、伴有鳞屑和皮肤溃烂等皮肤真菌病临床症状;六胺银染色发现感染部位皮肤有菌丝入侵;H.E.染色结果显示感染部位皮肤出现局部角化不全、棘层肥厚,且乳头层和网状层有大量炎性细胞浸润,说明本研究成功构建了家兔须毛癣菌型皮肤真菌病模型。(2)在12个链特异性RNA-seq文库中共鉴定出19,720个可靠的蛋白编码基因,包括10,620个已知的蛋白编码基因和9,100个新鉴定出的蛋白编码基因。在TM组与NS组间共鉴定出292个差异表达的蛋白编码基因(q0.05),其中227个在TM组中高表达,65个在TM中低表达,部分差异表达的蛋白编码基因可能通过参与真菌识别、炎性反应或营养性免疫(nutritional immunity)应答须毛癣菌感染;GO富集分析表明差异表达蛋白编码基因主要富集在免疫应答(Immune response)、应答外界刺激(Response to external stimulus)、炎性应答(Inflammatory response)、防御应答(Defense response)和应答应激(Response to stress)等生物学通路中。KEGG分析表明差异表达蛋白编码基因主要富集在细胞因子间相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、TLR信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NK细胞介导细胞毒性(Natural killer cell mediated cytotoxicity)、趋化因子信号通路(Chemokine signaling pathway)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)和NF-kappa B信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等信号通路中。(3)在12个链特异性RNA-seq文库中共鉴定出5,883个lncRNAs,与已知蛋白编码基因相比,本研究鉴定出的lncRNAs长度更短,外显子数较少,外显子长度较长。64个差异表达的lncRNAs中,43个在TM组中高表达,21个在TM组中低表达。共表达分析表明,32个差异表达的lncRNAs和96个蛋白编码基因间存在107个高度相关(|r|0.8)的相互作用关系。GO富集分析表明相关的蛋白编码基因主要富集在角蛋白丝(Keratin filament)、抗原结合(Antigen binding)、MHC蛋白复合物(MHC protein complex)、抗原加工和呈递(Antigen processing and presentation)、IL-1受体结合(Interleukin-1 receptor binding)和免疫应答(Immune response)等生物学通路上。KEGG Pathway富集分析发现相关的蛋白编码基因显著富集到抗原加工和呈递(Antigen processing and presentation)、吞噬作用(Endocytosis)、Jak-Stat信号通路(Jak-Stat signaling pathway)和细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)等信号通路,暗示lncRNAs可通过与蛋白编码基因共表达参与家兔皮肤真菌病的形成;MiRPara分析发现,173个lncRNAs包含9,561个预测miRNAs的前体序列,其中641个miRNAs可靶向10个蛋白编码基因。GO富集分析表明这些蛋白编码基因主要富集到免疫系统过程(Immune system process)、应答应激(Response to stress)和应答刺激(Response to stimulus)等可能与家兔皮肤真菌病相关的条目中,推测lncRNAs能通过被加工成miRNAs来参与家兔皮肤真菌病的形成。(4)用不同浓度β-glucan模拟真菌抗原刺激家兔KC后发现,20μg/mLβ-glucan对KC的抑制率(IR)接近10%,可作为感染KC的最适浓度;用20μg/mLβ-glucan感染KC 24 h后,感染组KC中CXCL8、CXCL11和IL-1β分泌量明显高于对照组,表明β-glucan诱导家兔KC炎症细胞模型构建成功。在KC炎症细胞模型中发现,β-glucan刺激能诱导JAK2 mRNA和p-STAT3表达;沉默JAK2的表达可抑制β-glucan诱导的p-STAT3表达和IL-1β分泌;过表达JAK2能进一步促进β-glucan对p-STAT3蛋白和IL-1β的诱导作用。说明β-glucan能通过激活JAK2/STAT3信号通路诱导IL-1β分泌,也说明KC中由JAK2/STAT3信号通路诱导分泌的IL-1β参与须毛癣菌感染家兔背部皮肤引起的炎症。本研究在家兔皮肤真菌病疾病模型基础上,筛选出了大量与家兔须毛癣菌型皮肤真菌病相关的蛋白编码基因和lncRNAs,并在β-glucan诱导的KC炎症细胞模型中对JAK2/STAT3信号通路和部分基因的作用进行探究,为深入揭示家兔皮肤真菌病形成的分子机制提供了理论基础,也为家兔皮肤真菌病的抗病育种提供参考依据。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.291
【图文】：

效应细胞,皮肤,细胞

障、生化屏障和感知作用等；免疫功能包括维持机体自我耐受性、阻止过敏反应和抑制自身免疫等[60]。1.3.2 皮肤的解剖学结构皮肤功能多样性与皮肤的解剖学结构密切相关。皮肤主要由表皮和真皮构成，中间被基膜隔开。表皮由下至上分别是基底层、棘层、颗粒层和角质层，其中角质层由角质细胞（即死亡的表皮角化细胞）构成，角质细胞与皮肤中的汗液、脂类和抗菌肽联合形成了皮肤的物理和生化屏障。表皮中的细胞成分主要有表皮角化细胞（keratinocytes，KC）、黑色素细胞、朗格汉斯细胞、T 细胞和神经末梢细胞（亦作默克尔细胞）。真皮由外至内分别为乳头层和网状层，主要包括血管和真皮树突状细胞、αβT 细胞、γδT 细胞、NK 细胞、B 细胞、肥大细胞和巨噬细胞等[60]（图 1-1）。

文库构建,凝胶电泳,完整性,纯度

25图 2-1 RNA 质检和定量流程Fig. 2-1 The schedule of RNA quality check and quantification的检测主要包括 4 各部分：糖凝胶电泳检测 RNA 降解程度以及是否有污染；Photometer spectrophotometer 检测 RNA 的纯度（OD260t 2.0 Flurometer 对 RNA 浓度进行精确定量；nt 2100 精确检测 RNA 的完整性。文库构建和测序

工作流程图,工作流程,软件,转录组

（3）当单端测序 reads 中含有的低质量（sQ≤5）碱基数超过该条 read 碱基0%时，去除此 paired-end reads。3.6 Hisat2 参考序列比对分析使用转录组数据比对软件 Hisat2[182]将 clean reads 分别比对家兔转录本及参组（Oryctolagus_cuniculus.OryCun2.0.dna_sm.toplevel.fa）。该软件首先给出两索引的策略，BWT（Burrows-Wheeler Transform）和 FM（Ferragina-Manzin，而后在索引基础上进行快速 Mapping 定位，发现 Indel、SNP 等位点信息。H比目前其他 RNA-seq 分析软件（如 Tophat2[183]）具有更高的准确率及搜索效软件部分流程如图 2-2。

【相似文献】