空肠弯曲杆菌中Cas9基因与毒力的关系研究

发布时间：2020-08-20 11:31

【摘要】：近年来由空肠弯曲杆菌感染引起的人类及动物性疾病越来越多,为了更好的预防和控制疾病的产生,必需更加清楚的了解致病菌毒性产生的机制和原因。另外由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)和Cas基因(CRISPR-associated)组成的CRISPR-Cas系统作为细菌的一种适应性免疫系统,被发现其与细菌的毒力有密切的相关性。CRISPR-Cas系统通过整合外源的DNA进入CRISPR序列中,来识别二次入侵的外源DNA从而将外源DNA降解,达到抵抗外源可遗传物质入侵的目的。既然CRISPR-Cas系统可以阻止外源DNA对自身的损害,那么CRISPR-Cas系统是否也可以使细菌能够更快或更慢的进入到其他的生物体中。近十年来,CRISPR-Cas9系统作为一种新型的基因编辑技术已经在不同的生物体中被应用。虽然CRISPR-Cas9系统作为一种新型的基因编辑技术在不同的生物体中都被应用,但是它对细菌的作用,却还停留在适应性免疫防御的作用,对细菌毒力方面的作用,目前还很少有相关的文献报道。所以本课题研究的目的是了解肉鸡空肠弯曲杆菌NCTC11168中Cas9基因和毒力之间的关系。主要从两个方面来探讨Cas9和毒力的关系,一方面从毒力表型考察,另一方面从毒力基因型探讨。通过结合这两个方面,全面了解Cas9和细菌毒力的关系,从而为解决空肠弯曲杆菌的风险管理和危害控制提供更多的理论依据。采取融合PCR技术构建同源重组载体。在Cas9基因的上游和下游各扩增1300bp左右的片段,并扩增出Kan基因,大小约1200bp作为筛选基因,然后将这三个片段按照融合PCR的方法以上游片段-Kan基因-下游片段的顺序连接起来,最后再连接到pGEM-Teasy载体上,构建出同源重组载体p3HKan5H。将p3HKan5H载体通过电转化和自然转化进入空肠弯曲杆菌NCTC11168中,筛选出突变菌,并进行突变体的验证。测定野生菌与突变菌的生长能力、鞭毛的形态和迁移力、生物膜的情况,来考察Cas9基因对细菌自身毒力表型的影响。测定的生长力的结果显示:采用t检测的方法考察,野生型菌与突变菌的生长力并没有显著性差异。迁移力的结果显示:野生型菌的迁移力明显比突变菌强,两者之间存在着显著的差异性。迁移力主要与细菌的鞭毛运动有关,既然迁移力有显著的差异性,可能Cas9基因对细菌的鞭毛有一定的作用。所以采用冷冻透射电镜观察鞭毛的形态,观察其是否有显著的变化,但是结果显示,野生型菌与突变菌的两极都存有较长的且完整的鞭毛,说明敲除Cas9基因后,鞭毛的形态并没有发生显著变化。生物膜结果显示:突变菌的生物膜的形成能力比野生菌的弱。可以初步说明Cas9基因对空肠弯曲杆菌的毒力是有一定的影响的。测定了细菌本身的毒力变化外,还需要对细菌的体外毒性进行检测,包括检测菌株对细胞的侵袭力和粘附力,以及菌株在体外的生存能力。实验采用鼠源的巨噬细胞RAW264.7和结肠癌细胞Caco-2,采用庆大霉素保护法对野生型菌和突变菌进行细胞实验。实验结果显示,敲除Cas9基因后,对粘附力和侵袭力并没有显著性差异,但对细胞内的生存能力具有显著性差异,表现出减弱的趋势。采用MTT实验方法来测定细菌的毒力产生能力,通过测定细菌的产毒能力,来检测细菌的致病性。实验结果显示,两者之间有显著的差异性且野生菌比突变菌的产毒能力强,说明敲除Cas9基因后,细菌的产毒能力下降。本实验采用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS),基于Illumina NextSeq500测序平台,对构建的文库进行双末端(Paired-end,PE)测序。RNA-Seq的主要目的是检测敲除Cas9基因后,有哪些毒力基因会发生变化,从而找出Cas9基因与这些毒力基因的关系。总得来说,表型结果显示,△Cas9突变体与野生型菌相比,在迁移力、生物膜的形成能力、细胞内的生存能力以及产毒能力这四个方面均表现出减弱。毒力基因型方面,RNA-Seq结果显示,所有的差异基因中,只有被敲除的Cas9基因出现下调,其他的基因均表现出上调,上调表达的基因中并没有出现直接与毒力相关的基因,都是一些参与代谢的蛋白以及功能未知的假定蛋白。综合分析得出,敲除Cas9基因,毒力表型表现出下调的作用,毒力基因型并没有出现直接的变化,考虑可能是通过负调控的作用来调控相关毒力的变化。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

示意图,示意图,缺失突变体,片段

2.6.1 载体构建方案采用融合 PCR 方法构建缺失突变体载体，融合 PCR 构建缺失突变体载体的方案如图2-1。由于之前所用的菌株是之前实验室筛选出来的多耐药强致病菌株1655，但是根据已有的全基因组测序结果设计引物扩增同源臂、Cas9 基因及 Cas9+片段，都扩增不出正确的条带，即使是扩增出来大小与目的大小一致的条带，送公司测序一样是比对不上，所以最后确定换菌株，换成野生型菌 NCTC11168 来进行实验。在NCBI 上通过 Blast 从空肠弯曲杆菌 NCTC11168 的基因组中找到 Cas9 基因，并将该基因上游和下游紧邻的序列片段一并找出。设计引物对 3H-F1/R1扩增 1300 bp 左右的上游同源臂片段，引物对 5H-F1/R1扩增 1300 bp 左右的下游同源臂片段，以空肠弯曲菌 NCTC11168 为模板进行 3H 和 5H 的扩增。同时设计引物对 Kan-F2/R2扩增Kan 基因盒。使引物 Kan-F2的 5

图 3-1 扩增 Kan 基因的结果Fig.3-1 PCR result of Kan gene注：M：2000Marker 1-5 泳道：Kan 基因Note: M: 2000Marker 1-5 lane: Kan gene5kb

图 3-2 扩增 3H 同源臂的结果Fig.3-2 PCR result of 3H homologous arm注：M：2000Marker 1-3 泳道：3H 片段Note: M: 2000Marker 1-3 lane: 3H fragment0.75kb

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