MiR-29b对乳腺上皮细胞凋亡和甘油三酯含量的影响

发布时间：2020-08-20 11:41

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是存在于生物体内22个核苷酸左右的重要短基因片段。其在脂类代谢中也是重要的调控因子,而脂类是牛奶的主要成分,对幼畜的成长和发育有着至关重要的作用。所以,筛选出来这些影响乳脂代谢和乳腺上皮细胞活力的miRNAs成为研究人员重要的研究工作之一。miR-29b作为众多关键miRNAs中的一员,参与许多重要的生命过程,包括癌细胞的增殖迁移和肠上皮细胞的增殖等。另外,经对高脂奶牛和低脂奶牛乳腺组织分析发现,mi R-29b的表达量在两者间存在着显著的差异表达,表明miR-29b可能是调控脂质代谢是关键因子。miR-29b通过调控靶基因参与乳脂代谢和细胞凋亡过程,所以本研究首先通过生物信息学分析预测并且分析了与miR-29b有关的潜在靶基因,结果显示,mi R-29b可以识别4353个转录子中5730个结合位点。经功能分析,我们初步锁定LPL和TDG基因作为本研究的靶基因。LPL-3'-UTR(1802-1809 bp)和TDG-3'-UTR(1057-1064 bp)分别存在能与miR-29b成熟序列所包含的种子序列(AGCACCA)特异性识别的位点。然后根据结合位点我们分别设计了包含LPL-3'-UTR-WT(UGGUGCUA),LPL-3'-UTR-mut(CAAGUACG),TDG-3'-UTR-WT(UGGUGCUA),TDG-3'-UTR-mut(CAAGUACG)的载体。双荧光素酶报告系统检测发现,与参照组比较,miR-29b mimics和TDG-3'-UTR-WT共转染组荧光素酶活性显著低于对照组(p0.05),而和TDG-3'-UTR-mut共转染组与对照组之间无显著差异(p0.05);miR-29b mimics和LPL-3'-UTR-WT共转染组荧光素酶活性显著低于对照组(p0.05),其和LPL-3'-UTR-mut共转染组与对照组之间也无显著差异(p0.05),进一步验证了TDG和LPL是miR-29b的潜在靶基因。为详细了解miR-29b是如何在细胞中发挥调控作用的,我们将合成的mi R-29b过表达载体(miR-29b mimics)、miR-29b抑制剂(miR-29b inhibitor)和阳性对照(miR-shNC)转染到乳腺上皮细胞中。荧光显微镜下观察到的绿色荧光表明载体成功转染到细胞中,并且经荧光定量检测说明miR-29b成功在乳腺上皮中过表达和干扰。实时荧光定量检测结果显示miR-29b mimics组的TDG和LPL mRNA的表达量显著降低(p0.01);随后进行的蛋白免疫印迹检测结果显示,TDG和LPL基因表达蛋白在miR-29b inhibitor组显著高表达,而在mi R-29b mimics组显著被下调,综合以上实验结果说明miR-29b可通过降解靶基因的mRNA或抑制靶基因的蛋白翻译这两种方式发挥其作用。随后,我们在乳腺上皮细胞中成功的过表达和干扰mi R-29b,探究mi R-29b对乳脂代谢和细胞凋亡的影响。经流式细胞仪检测发现,细胞凋亡率分别为mi R-29b mimics组(8.78%)、mi R-29b inhibitor组(21.86%)和miR-shNC组(17.1%),表明过表达miR-29b会抑制乳腺上皮细胞的凋亡。与此同时,沉默mi R-29b会促进乳腺上皮细胞的凋亡。在接下来的实验中,我们在乳腺上皮细胞中分别转染了miR-29b mimics、miR-29b inhibitor和miR-shNC,培养24 h后,检测了细胞内部甘油三酯的表达量。结果显示过表达miR-29b会显著促进甘油三酯的生成,但是干扰miR-29b却对甘油三酯的影响不明显,说明可能只有在mi R-29b表达量相对较高时对甘油三酯的形成才有影响。结合以上实验结果,我们推测miR-29b可能通过下调靶基因TDG和LPL实现其抑制乳腺上皮细胞凋亡和促进甘油三酯含量增多,为乳脂代谢过程提供基本的理论依据和分子机制分析。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.2
【图文】：

模式图,模式图,靶基因,种子区

图 2.1 miRNA 与靶 mRNA 的作用模式图Fig. 2.1 Relationship between miRNA and target mRNA-29b 与靶 mRNA 的作用模式有以下几种：首先，如果二者不完全互miRNA 与靶基因之间有特异性识别序列，但不能保证种子区完全，会影响靶基因翻译过程的正常进行而对 mRNA 的稳定性无任虫的 lin-4。第二种方式也就是二者完全互补，miRNA 种子区和分碱基完全配对结合后，类似 siRNA 与靶 mRNA 的结合，会发割 mRNA，如 miR39/miR171。最后，如果上述两种模式均具备。解靶基因与抑制蛋白翻译两种模式，如 let-7 果蝇/线虫。L-2 家族的 BAG3 可以与 MMP2 基因相结合，而 miR-29b 可以通过结合，从而在子宫内膜样腺癌细胞的侵袭过程中发挥作用[82]。转TGF β1）是调节纤维化和器官功能正常发挥的一把起到关键作icroRNA-29b 可以作为治疗子宫内膜纤维化潜在的治疗剂，通

靶序列,理论模型,脂肪细胞

igh density lipoprotein, HDL）。酯和极低密度脂蛋白（VLDL）水解的过程中，LP指的是催化循环乳糜微粒水解，使其分解为游离脂能将极低密度脂蛋白胆固醇转变为低密度脂蛋白胆糜微粒和中间密度脂蛋白的释放能够间接影响高密[109]，LPL 的缺失或是活性降低均会导致 VLDL 的降发挥功能的过程中，它也会受到多种 miRNAs 的能靶向巨噬细胞内的 LPL，沉默 LPL 基因后影响脂质动脉粥样硬化的发生发展[110]。在牦牛的脂肪细胞中的 3'UTR 的靶序列，增加了脂肪细胞特异性基因在脂。在小鼠的脂肪细胞中，miR-185 通过负调控 LPL 抑

理论模型,胞嘧啶

中必不可少的重要部分。在激活 CBP 的转录调控中，TDG 会与组蛋酶(Histone deacetylase, HDAC)和 CREB 结合蛋白共同作用进行维持。此G 也会与视黄酸受体 α（Retinoic acid receptorα, RARα）相互作用，激活体 α 基因下游的靶基因。同时，在 5-甲基胞嘧啶（5-MeC）和胞嘧啶中引发的 DNA 错配，从而在后期的 G/T 和 G/Ud 胞嘧啶碱基切除ER）过程中都起到了决定性的作用[144]。 TDG 功能分析

【参考文献】