牦牛冷暖季卵巢差异分析及添加褪黑素对牦牛卵母细胞体外成熟、胚胎体外发育的影响

发布时间：2020-08-20 13:21

【摘要】：(1)试验利用组织学和转录组学技术,对在暖季(W-yak)和冷季(C-yak)的牦牛卵巢状态变化进行研究。收集的卵巢样品分为W-yak和C-yak两组,分别测定其黄体数量、卵泡发育和RNA-Seq分析。结果表明:(1)W-yak牦牛黄体数量明显高于C-yak(P0.05),其中8月和9月的牦牛排卵最为集中;(2)C-yak(11月)卵巢中卵泡发育过程中断,与W-yak(7月)相比,这是由于窦卵泡的异常积聚所导致;(3)多囊泡现象代表C-yak卵巢窦卵泡内颗粒细胞功能紊乱;(4)RNA-seq数据显示,如FST,CYP1A1,GNAI2和PI3K等雌激素分泌和代谢信号通路在C-yak卵巢中是紊乱的,本研究获得W-yak和C-yak之间卵巢形态变化和不同基因表达,并提供了与卵巢状态相关的试验数据。卵巢功能的这些重要变化与繁殖能力紧密相关。结果表明季节和气候变化不利于雌性生殖健康,并为长期营养缺乏和低温胁迫下可能导致卵巢功能障碍提供理论依据。(2)研究在卵母细胞成熟和/或胚胎培养液中添加不同浓度的褪黑素对牦牛卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育的影响;结果表明,在试验1中,与对照组相比,IVC+10~(-9)组和IVC+10~(-11)组,卵母细胞成熟率显著提高(67.9%vs 82.4%,78.4%),囊胚率形成显著提高(36.8%,34.4%vs 26.3%),成熟卵母细胞降低ROS水平、细胞凋亡率和纺锤体错位与染色体异常的发生率,提高线粒体膜电位;在试验2中,在胚胎体外培养中,与对照组相比,IVC+10~(-9)组和IVC+10~(-11)组囊胚率显著提高(26.3%vs 35.4%,31.8%)。此外,与对照组相比,在IVC+10~(-9)组中观察到囊胚中凋亡细胞的数量和百分比降低(6.9±0.6;5.5%vs 3.5±0.4;3.0%)。在试验3中,IVC+10~(-9)组减少囊胚凋亡细胞数,抗氧化基因(SOD2)和热休克蛋白(HSPB1)mRNA表达量升高,促凋亡基因p53、Bax和capase-3的表达量降低,抗凋亡基因BCL2L1、Survivin的表达水平显著高于对照组;与IVM+10~(-9)相比,IVM/IVC+10~(-9)处理组的活性氧物质产量升高。总之,添加10~(-9)M浓度的褪黑素在牦牛胚胎体外生产阶段直接影响胚胎发育能力和质量。(3)褪黑素作为一种抗氧化剂在多种细胞中扮演着重要的角色,保护细胞内的分子免受氧化应激,褪黑素在牦牛胚胎中的抗氧化作用机制尚不清楚。在H_2O_2氧化应激下,通过对牦牛胚胎培养过程中添加不同浓度的褪黑素,考察牦牛胚胎发育过程中卵裂及囊胚形成的影响,并通过检测受精卵内活性氧水平、线粒体膜电位、抗氧化酶活性、细胞数量及内细胞团(ICM)/细胞总数(TCN)的比值等指标,考察褪黑素在牦牛胚胎中的抗氧化作用机制,结果表明,牦牛受精卵暴露于褪黑素的环境下,保护牦牛胚胎发育免受过氧化氢(H_2O_2)诱导的氧化应激损伤,保持受精卵线粒体功能稳定,T-AOC、GSH-Px、CAT活性升高,降低了H_2O_2诱导的细胞内ROS水平,进一步证明褪黑素通过保存抗氧化酶来保护着床前胚胎免受氧化损伤。这些结果共同证实了褪黑素对牦牛胚胎发育过程中的抗氧化作用,显著提高了牦牛胚胎体外生产中囊胚的数量和质量。(4)褪黑素减少了牦牛SCNT胚胎的细胞凋亡和ROS水平,增加了细胞数量,ICM细胞数量,以及ICM与TCN的比例;基因表达分析表明,褪黑素抑制促凋亡基因p53和Bax的表达,并刺激SCNT囊胚中抗氧化基因SOD2和Gpx4,抗凋亡基因BCL2L1和多能性相关基因SOX2的表达。在囊胚期添加褪黑素,SCNT-T组胚胎的全基因组H3K9ac水平高于SCNT组胚胎。结论,外源性褪黑素可以影响与细胞凋亡,抗氧化功能和发育相关的基因的表达,减少牦牛SCNT胚胎的细胞凋亡和ROS水平,提高胚泡质量,从而最终提高牦牛的克隆效率。(5)探讨褪黑素处理成纤维细胞后,将其作为供体细胞对牦牛体细胞核移植隆牦牛胚胎体外发育能力和质量的影响。在10~(-9) M褪黑素浓度下,显著增强成纤维细胞(PFF)的增殖,供体细胞甲基化水平H3K9me3、H3K9me2、和H3K18ac显著升高,促凋亡基因p53、Bax的表达水平明显降低,抗凋亡基因BCL2L1的表达水平明显增加,并且在10~(-9) M褪黑素处理的供体细胞组中囊胚率显著增加,细胞总数和ICM细胞数以及囊胚的ICM:TCN的比率显著提高;降低囊胚期胚胎凋亡细胞的发生率和细胞内ROS水平,提高的全基因组H3K9ac和H3K18ac乙酰化水平;囊胚中发育相关基因OCT4和多能性相关基因SOX2,抗氧化基因SOD2、Gpx4和热应激蛋白HSPB1的表达水平在SCNT-T组中显著上调,促凋亡基因p53和Bax的表达水平显著低于SCNT组,抗凋亡基因BCL2L1和Survivin表达水平显著高于对照组和SCNT组。本研究确定了供体细胞的经褪黑素处理可以促进牦牛克隆胚胎的发育。10~-99 M褪黑素的最佳浓度处理的重构胚,可以增强牦牛SCNT囊胚的形成和改善胚胎质量。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.85
【图文】：

褪黑素,对合

图 1-2. 褪黑素在不同阶段的应用对合和体外胚胎产生的影响Figure1-2. Effects of melatonin application in different steps on gametes and in vitro embryoproduction.褪黑素作为一种有效的自由基清除剂，可直接降低 ROS 浓度，防止内源性抗氧化酶的消耗；清除潜在抗氧化剂对 ROS 的反应，包括单态氧、一氧化氮、过氧化氢、氢氧自由基，以及 RNS 包括硝酸、过氧亚硝基、过氧亚硝基酸等。褪黑素能够上调几种抗氧化蛋白的基因表达和活性，线粒体最佳功能得以保留，有助于维持抗氧化应激的稳态，其代谢产物表现出强大的抗氧化能力（Mayo, Sainz et al. 2002, Carmen, Juan C etal. 2010）。褪黑素很容易与释放 NO 的超氧化物结合，从而阻止过氧亚硝酸盐的形成，这是一种比 NO 更有害的自由基。它被描述为一种直接过氧化亚硝酸盐清除剂（Thakor,Herrera et al. 2010）。1.2.5 褪黑素调节合子和体外生产的氧化应激褪黑素的两亲性使褪黑素能够容易通过生物屏障。这种特性使其成为一种有效的抗氧化剂，从而保护胚胎免受 ROS 的侵害（Cruz, Leal et al. 2014）。在对哺乳动物卵母

冷暖,季节

冷暖季节放牧牦牛Figure2-1Yakgrazinginwarmandcoldseasons

有腔卵泡,生长卵泡,牦牛,成熟卵泡

图 2-2. 冷暖季节牦牛卵巢黄体、生长卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡数量及形态学观察Figure 2-2. Morphological observationmean and number of corpus luteum, growing, antral and maturefollicles per yak ovary in warm and cold season注：比较不同季节牦牛卵巢黄体、生长卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡的平均数量。A：2016 年 7 月至 12 月每个卵巢黄体平均数量。B：2016 年 7 月至 12 月每个卵巢生长卵泡数量。C：2016 年 7 月至 2016 年 12 月每个卵巢的窦卵泡数量。D：2016 年 7 月至 12 月每个卵巢成熟卵泡数。E：牦牛卵巢不同发育阶段卵泡的分类。组间差异有统计学意义（P<0.05）。数据表示为平均值±标准差，试验重复三次。标尺=100μm。Note: A: The mean number of corpus luteum per ovary from July to December in 2016. B: The number of growing folliclesper ovary from from July to December in 2016. C：The number of antral follicles per ovary from from July to December in2016. D：The number of mature follicles per ovary from from July to December in 2016. E：Classification of different

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