沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡生产性能及预防沙门氏菌感染的效果研究

发布时间：2020-08-20 22:51

【摘要】：胞外囊泡(Outer membrane?vesicles,OMVs)是细菌在生长过程中从细胞膜向细胞外空间分泌的具有脂质双分子层结构的纳米级囊泡体。它含有细菌细胞膜蛋白、脂质和核酸等多种生物活性分子,在细胞间传递信号,具有多种生理功能,如:介导细菌-宿主间的相互作用、呈递细菌抗原、调节宿主免疫系统功能等。随着对OMVs生物学特性和功能的研究不断深入,OMVs作为细菌抗原载体的潜力及对宿主免疫系统的调控作用已引起学界的广泛关注。本试验以纳米级的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium,ST)胞外囊泡(ST-OMVs)作为免疫佐剂,探究其对肉仔鸡生长性能、血清免疫指标以及对抗ST感染能力的影响,为新型疫苗防控鸡沙门氏杆菌疾病奠定基础。试验一沙门氏菌胞外囊泡的分离鉴定与生物特性分析鼠伤寒沙门氏菌经过无菌环境下的纯化、培养,采用差速离心法从ST培养液上清中富集ST-OMVs,随后采用密度梯度离心法进行纯化得到纯化ST-OMVs。(1)扫描电镜检测ST-OMVs,结果显示:ST-OMVs的形态大小不一,无杂质视野清晰,平均直径为100 nm左右,符合细菌胞外囊泡的颗粒粒径要求。(2)采用激光纳米粒度分析仪检测所获得纯化ST-OMVs的粒径分布,结果显示MODE粒径的峰值为76 nm,其曲线平缓流利,说明含有的杂质较少,纯度较好。MODE粒径与细菌OMVs的理论颗粒粒径值基本吻合,偏离的小部分可能与颗粒之间的粘着程度有关。(3)采用BCA法检测ST-OMVs的蛋白含量,结果表明1×10~100 particles/mL的ST-OMVs的蛋白含量为7.3μg/mL。试验二沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡生产性能及预防沙门氏菌感染的效果研究350只1日龄健康爱拔益加雏鸡清洁环境中饲养至7日龄,选择沙门氏菌感染为阴性、健康、体重差异不显著的雏鸡320只随机等分为5组,每组8重复,每重复8只。试验设计为未感染的对照组(PBS组)、沙门氏杆菌感染组(ST组,攻毒试验用)和3个不同OMVs免疫剂量免疫组,分别注射5、10和20μg/d/只的OMVs(OMV5、OMV10和OMV20),试验期日粮和常规饲养管理按本品种饲养指南进行。雏鸡分别在8-10、15-17、22-24日龄3次、每次连续3天、每天1次性对3个OMVs免疫组雏鸡腹腔分别注射设计剂量的OMVs;同时,PBS组和ST组雏鸡分别注射等容量的PBS溶液。试验鸡30日龄时,对ST组和3个OMVs免疫组鸡腹腔1次性注射0.5 mL的1×10~9 CFU/m L的ST进行攻毒,PBS组鸡注射等容量的PBS溶液,饲养5天后观测鸡群健康变化;试鸡50日龄时,对前期试验健康观测最佳免疫OMV10组鸡腹腔1次性注射0.5 mL的5×10~9 CFU/mL的ST进行攻毒,饲养观察5天。结果表明:(1)OMVs对肉仔鸡生产性能和免疫功能影响试验与PBS对照组相比,OMV5和OMV10组的试验鸡日均采食量、平均日增重和饲料转化率均无显著差异(P0.05),而OMV20组的试验鸡日均采食量和平均日增重显著降低(P0.05)、饲料转化率显著增加(P0.05);3个OMVs免疫组试验鸡的死亡率及免疫器官指数与PBS组均无显著差异(P0.05);OMVs免疫可显著提高肉仔鸡血清溶菌酶活力、白蛋白含量、C3含量及SOD活力(P0.05)。(2)OMVs对肉仔鸡ST攻毒后的免疫保护试验试期30日龄雏鸡对ST组和3个OMVs免疫组同剂量ST攻毒后观测5天发现,与ST组比较,3个OMVs免疫组鸡攻毒后均能够消除ST感染引起的试验鸡体重下降(P0.05),显著提高(P0.05)ST感染试验鸡的存活率,尤以OMV10和OMV20免疫组效果最好。此外,10μg/d/只的OMVs免疫可显著降低ST感染后血液中的IL-1β和TNF-α的含量(P0.05),且有降低IL-6含量的趋势(P=0.074)。试验第50天对PBS组和OMV10组攻毒后观测5天,两组鸡的存活率无显著差异(P0.05),说明OMVs对肉仔鸡的免疫持久性良好。试验结论:(1)利用差速离心和密度梯度离心相结合的方式能获得纯化程度较高的OMVs;利用扫描电镜观察与Nanosight颗粒粒径分析相结合方法鉴定OMVs形态,准确性好。(2)OMVs具有增强肉仔鸡免疫的功效,主要表现在能提高肉仔鸡血清溶菌酶和SOD活力、以及白蛋白和C3含量;能够消除ST感染引起的肉仔鸡体重下降,提高ST感染后肉仔鸡存活率;OMVs对肉仔鸡抵抗ST感染的能力具有良好持久性。(3)OMVs增强肉仔鸡免疫具有明显的剂量效应。较大剂量(如20μg/d/只)会对肉仔鸡生产性能、甚或成活率造成负面影响;适度剂量则没有此效应。本试验中,10μg/d/只的免疫剂量为最佳免疫剂量。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.31
【图文】：

形态图,耻垢分枝杆菌,细菌,形态

.1.2 细菌胞外囊泡的形态特征对最初富集的细菌胞外囊泡的物理特性的初步表征很重要，据此能确定它们的，如尺寸、形态、产量、浓度和成分。但这需要用一套分析技术来完成（Jain and P7），包括电子显微镜（Electron microscopy, EM），免疫印记（Western blotting白质（Total protein）的估计和单个粒子的跟踪（Individual particle tracking）等。了关于囊泡的结构形态、完整性和亮度的合理定性信息；总量蛋白质的数量，计从培养基中获得细菌胞外囊泡产量的黄金标准；纳米粒子跟踪分析（Nanopacking analysis, NTA）等方法对单个粒子进行形态分析，所有这些都有助于确定它和大小。在透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）下可以菌胞外囊泡是直径在 50-200 nm 间的球状结构，是一种定性的视觉比较，具体所示，是在 TEM 下观察到不同分离法得到的的耻垢分枝杆菌（Mycobacteegmatis）胞外囊泡的的形态结构（Jain and Pillai 2017）。图 1-2 提供了一个典A 对细菌胞外囊泡的描述结果，包括悬挂的细菌胞外囊泡的视觉图像和每个大小布的量化结果。通过不同的方法获得细菌胞外囊泡的大小浓度，再结合其组成成更全面的了解其功能特性以便为后续研究提供科学的依据。

细菌,假单胞菌,宿主

图 1-2 NTA 法观测细菌胞外囊泡Fig. 1-2 Observation of bacterial extracellular vesicles by NTA(Jain and Pillai 2017)1.2.1.3 细菌胞外囊泡的功能现在对囊泡的机械原理和功能已有一定的了解，但是它的生物源和调控原理还是不完整的，它们在细胞间通讯、基因转移、毒性因子的运输、抗原和毒素以及疾病发病机理等方面的作用已多有研究成果（Remis et al. 2014; Yaron et al. 2000）。（1）细菌胞外囊泡的生理功能细菌的基因型和包膜结构的多样性解释了膜囊泡功能的多样性。通常，细菌利用这些小囊泡来提高它们在环境中生存的机会。细菌胞外囊泡与支持细菌生存的许多功能有关，包括生物膜的形成，种内基因和营养的转移，生态防御和细胞间通信。例如，从假单胞菌 PAO1（p.aeruginosa, PAO1）中释放的细菌胞外囊泡能够裂解与自身竞争的细菌如：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），大肠杆菌（E. coli）和假单胞菌 8803（Pseudomonas 8803）（Kadurugamuwa and Beveridge 1996）。来自牙龈卟啉单胞菌（Pgingivalis）的囊泡通过转运 PPAD 酶到宿主抑制了补体因子 C5a 从而增强了宿主的免疫系统（Bielecka et al. 2011）。这些报道很好地说明了细菌胞外囊泡在促进母细菌存活方

生物功能,细菌

来自各种病原菌的细菌胞外囊泡与上皮细胞和免疫细胞相互作用从而（Cytokines）、趋化因子（Chemokines）和抗菌肽（Antimicrobial peptide通过激活或者抑制它们的细胞对这些疾病进行调节。KaparakisLiaskos 和5）对细菌胞外囊泡对宿主免疫反应的调节机制进行了广泛的研究。这些囊种毒性因子，如碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）、溶血性磷脂酶 C（Hholipase C）和胆囊纤维调控因子（Cystic fbrosis transmembrane regulator, 子（Inhibitory factor, Cif），从而影响宿主细胞生物学（Bomberger et al. 它们还会引发免疫调节活动，在针对脑膜（N. meningitidis）疫苗的生产中用了（Durand et al. 2009b）。抗原可以在细菌胞外囊泡表面显示，从而在烈的炎症和免疫反应。例如，Alaniz 等（2007）的研究表明：鼠伤寒沙门外囊泡可以刺激促炎因子的产生，如肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis fact）和白介素-2（Interleukin-2, IL-2）而且 CD4+T 细胞被激活。总之，这些菌胞外囊泡在疾病发病机理中的广泛作用。图 1-3 总结了细菌胞外囊泡的能。

【参考文献】