猪流行性腹泻病毒感染Marc-145细胞的转录组学及蛋白质组学分析

发布时间：2020-08-21 13:24

【摘要】：猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种经粪-口途径传播的急性肠道传染病,其病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。PEDV虽然在感染成年猪时仅产生消瘦等轻微症状且鲜见死亡病例,但在感染新生仔猪时则表现出100%的高发病率和90%~100%的高致死率。PEDV目前在全球都已有感染并暴发的报道,严重威胁着养猪业的发展。所以对PEDV的基础研究提出了更高的要求,而基于现代测序技术的数据则具有一定的指导意义。为此,本研究将PEDV接种于无天然免疫缺陷的Marc-145细胞中,再借助于RNA测序(RNA-seq)技术及同位素标记相对和绝对定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification,iTRAQ)技术分别测定了感染PEDV前后的Marc-145细胞的转录组与蛋白质组的变化,并对两组数据进行了生物信息分析及串联分析,获得了以下结果:1.将对照组及接毒组细胞进行基于RNA-seq技术的高通量测序,在测序数据与非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)参考基因组比对之后,将鉴定出的基因进行功能注释,最后筛选出接毒组中呈现差异表达的基因,并对其进行GO(Gene Ontology)与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析,结果如下:从对照组与接毒组中分别鉴定到18452个与18286个基因中共筛选出832个差异表达基因,其中表达上调的有497个,表达下调的有335个;在GO分析的分子功能、细胞组分及参与的生物过程共3项本体中分别富集到440、291及2700条GO term,其中在生物过程中有27条GO term呈现为显著富集,主要涉及信号转导、应激及凋亡等,而在分子功能与细胞组分中富集程度最高的GO term则分别主要与DNA结合及细胞骨架成分有关;在KEGG分析中共富集到167条Pathway,其中有涉及免疫反应、凋亡及细胞周期的Pathway,而呈显著富集的Pathway则是与胞外信号转导密切相关的MAPK与Jak-STAT信号通路;与天然免疫、炎性反应相关的基因出现差异表达,其中IFNB1、EGFR、IL11、RSAD2与ISG15等基因的表达出现了显著上调,表明在病毒的诱导下,细胞的天然免疫及炎性反应被激活,然而还有IFNA、IL23A等基因的表达出现了显著下调,表明PEDV可通过某些机制抑制了部分的天然免疫及炎性反应;与细胞凋亡相关的基因出现差异表达,其中TRAILR、DFF40、NGF等的上调表达与TRAIL、BIRC3的下调表达表明在一部分细胞中凋亡被诱导,而在另一部分细胞中凋亡被抑制,提示病毒可能通过对细胞凋亡的调控以实现更高的病毒滴度;与细胞周期相关的基因出现差异表达,其中GADD45B、p300、Mdm2等的上调表达与HSP105、HSP70等的下调表达提示可能发生了细胞周期阻滞。2.借助了iTRAQ串联液相质谱对接毒组及对照组的Marc-145细胞进行蛋白组学测序,将筛选出的差异表达蛋白进行GO与KEGG富集分析,结果如下:从鉴定到的3346个蛋白中共筛选出478个差异表达蛋白,其中表达上调的有423个,表达下调的有55个;在GO分析的分子功能、细胞组分及参与的生物过程共3项本体中分别富集到201、211及1342条GO term,其中显著富集GO term分别为45、66及255条,分别主要涉及RNA结合与翻译调控、细胞骨架与通道复合体、细胞周期与跨膜转运等;在KEGG分析中共富集到包括p53、mTOR、MAPK信号通路在内的67条pathway,其中显著富集的有ErbB、HIF-1、Wnt、细胞周期信号通路等共29条;核糖体相关蛋白表达上调,表明病毒可能正通过劫持细胞的蛋白合成机能来进行自身的复制,而其中RPL11、RPL23、RPL26、RPS25、RPS27等蛋白的上调表达则提示可能发生核糖体应激;与细胞骨架相关的蛋白的表达发生变化,其中DCTN2、TUBA4A、MAP4等表达上调,而HSP27表达下调,反映了细胞骨架在病毒的感染下发生异常,且HSP27的下调表达还提示细胞可能发生了凋亡;与细胞周期相关的Cdc2、Mad1、Bub3蛋白表达上调,同样提示了细胞周期阻滞的发生。3.在转录组学及蛋白组学测序的基础上,对鉴定到的基因与蛋白进行了串联分析。在103个同时在转录及翻译水平发生变化的蛋白中共发现有52个在转录及翻译水平上呈现出一致性的变化,其中有35个出现上调,17个出现下调,这些蛋白主要与细胞骨架、细胞周期、信号转导等有关。而在转录及翻译水平上均呈现显著上调的TRIM56则可能参与了细胞对抗病毒的免疫反应,但其在PEDV感染过程中的具体作用需要进一步研究来报道,这也是首次在PEDV感染细胞的过程中发现该蛋白的参与。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28

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本文编号：2799430