牛白血病病毒感染与人乳腺癌发生相关性的研究
发布时间：2020-08-21 14:59
【摘要】：牛白血病病毒(Bovine leukemia virus,BLV)属于反转录病毒科(Retroviridae),丁型反转录病毒属(Deltaretrovims)。该病毒会引起牛淋巴细胞持续性增生,进而导致牛地方流行性白血病的发生。BLV的感染和传播非常普遍,其在中国有较高的流行率。近期,美国学者的研究发现,人类乳腺上皮细胞中存在BLVDNA。随后的研究中发现,BLVDNA在乳腺癌患者的乳腺上皮组织中的阳性率为58.8%(67/114),显著高于普通人群中的阳性率(28.8%,30/104)。这一发现提示,BLV感染可能与人类乳腺癌发生有潜在的联系。本研究建立了检测BLV前病毒的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并基于我国上海、江苏、安徽等地乳腺癌患者的乳腺组织和全血样品,采用多种高灵敏度的方法检测BLV的核酸和抗体,进一步探讨BLV感染与人类乳腺癌发生的相关性。一、检测BLV前病毒的LAMP方法的建立牛地方流行性白血病有多种诊断方法,包括病理组织学检测、血液学检测、血清学方法以及分子生物学检测。LAMP方法是一种可以在等温条件下扩增核酸的新型技术,具有操作简便,检测成本低的优势。本研究根据GenBank中提供的BLV基因序列,基于其保守区域设计内引物、外引物以及环引物,并建立BLV的LAMP反应体系。在此基础上,通过探索外内引物比例、Mg2+浓度、Bst 2.0 DNA酶的添加量以及dNTPs浓度,优化LAMP反应参数条件。同时,通过在反应体系中加入钙黄绿素试剂,实现结果的可视化判定。本研究建立了一种能够在25 μL反应体系中实现单拷贝病毒核酸检测的BLV LAMP方法,该方法灵敏度优于普通PCR检测方法,并有良好的特异性。二、BLV感染与人乳腺癌发生相关性的研究有研究发现在人的乳腺上皮组织中能够检测到BLV DNA,并推测BLV可能与人乳腺癌发生存在潜在的联系。乳腺癌的很多高危因素已被证实,但其发生的机理尚未清楚。BLV感染是否会引起乳腺癌的发生,这引起了众多研究者的关注。但截止到目前,并未证实BLV感染与乳腺癌发生存在关联性。根据我国BLV的分子流行病学调查,BLV在上海、江苏和安徽有较高的阳性率,所以本研究选择的乳腺癌患者的样品均来自上述三个地区,主要为乳腺组织样品和全血样品。91份乳腺癌患者的冰冻乳腺组织样品,其中66份来自上海健康所,25份来自江苏扬州苏北人民医院;160份乳腺癌患者的全血样品,其中140份由苏州大学第三附属医院提供,20份由安徽淮南朝阳医院提供。本研究采用100份正常人群全血样品作为对照组,该样品来自扬州市苏北医院2013年体检人群,体检人群均被确认为非乳腺癌患者。此外,本研究在安徽、北京、上海和江苏四个地区的奶牛场采集了 150份奶牛全血样品。本研究为了精确检测人类体内是否存在BLV的核酸和抗体,采用了 LAMP、PCR和ELISA多种高度灵敏、特异的检测方法。PCR方法包括:1)1种本实验室建立的FRET-qPCR方法;2)首次报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法,包括1种普通PCR方法和5种巢式PCR方法。LAMP方法为本研究所建立的BLV LAMP检测方法。ELISA方法为针对gp51蛋白的商业化ELISA试剂盒。奶牛全血样品检测的结果显示,LAMP和FRET-qPCR两种方法检出阳性率为50.0%,检测结果高度吻合。其中,ELISA方法检出阳性率为48.7%,其中4份样品由于奶牛处于BLV感染早期,体内抗体含量未达到ELISA试剂盒检测限。该结果证实上述三种检测方法的可行性。随后,采用这三种方法分别检测人的乳腺组织样品和全血样品,均未在样品中检测出BLV核酸或特异性抗体。此外,本研究使用已报道BLV和乳腺癌相关性的实验室建立的检测方法检测乳腺组织样品的核酸,同样未检测到BLV的核酸。因此,本研究认为BLV感染与上述地区人类乳腺癌的发生不存在直接的关联性。综上所述,本研究建立一种快速、灵敏的BLV LAMP检测方法,并研究证实在安徽、江苏、上海等3个地区,BLV的感染与乳腺癌的发生无相关性。由于遗传背景和牛奶消费习惯等方面的差异,不同人群中BLV的感染与乳腺癌发生的相关性还需要进一步的研究。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9;S858.23
【图文】：
３．邋结果逡逑３．１模板ＤＮＡ定量逡逑根据ＰＣＲ扩增的标准曲线（图２－１），得出标准方程，并计算出样品Ｂ１３６０的拷贝数，逡逑近似为２ｘｌ0３拷贝／以，即ＬＡＭＰ反应标准品的拷贝数为２ｘｌ０３拷贝／ｐＬ。逡逑Ｆｌｉａｏｒ？ｓｃS茫椋簦憷馘澹龋椋螅簦铮颍义希椋椋赍义希佩澹澹义希卞澹玻常矗担叮罚福瑰危保卞危保冲危郑峰澹保瑰危玻卞危玻冲危靛危玻峰危玻梗义希茫悖欤澹箦义贤迹玻保澹疲遥剩牛裕瘢校茫曳椒ǘ肯槠罚拢保常叮爸校拢蹋趾渴笛槔┰銮咄煎义希疲椋珏澹玻保澹裕瑁邋澹颍澹螅酰欤翦澹铮驽澹疲遥牛裕瘢校茫义澹恚澹簦瑁铮溴澹妫铮蝈澹拢蹋皱澹模危铃澹洌澹簦澹悖簦椋铮睿义希常插危蹋粒停蟹从σ锏纳杓棋义显谠な笛殄攵圆煌幕虺醪缴秆。缸椴煌囊铮溴恚玻持兴镜囊镥义峡诙∫猿晒椖康钠巍Ｆ渌橐锎嬖谝欢ㄈ毕荩械囊锢┰鲂式系停械囊镥义衔薹ń茇芎玫睦┰觯械囊镄枰缺湫缘某绦颉Ｔ谕瓿衫┰龇从Φ幕∩希诜从μ邋义舷靛尤牖芬铮估┰龇从σ切瑁矗靛澹恚椋罴纯赏瓿伞ｅ义希常冲危蹋粒停蟹从μ逑档慕㈠义希常常弊钍史从μ逑档娜范ㄥ义希常常保币锛浔壤挠呕义衔范ㄒ锛涞淖钣疟壤裕蹋粒停蟹从Ρ曜计肺０澹从μ逑瞪杓迫绫恚玻粗兴义鲜荆从崾笫勾ǎ玻ヅǘ惹碇悄航械缬炯觳狻ｅ义辖峁砻
本文编号：2799519
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R737.9;S858.23
【图文】：
３．邋结果逡逑３．１模板ＤＮＡ定量逡逑根据ＰＣＲ扩增的标准曲线（图２－１），得出标准方程，并计算出样品Ｂ１３６０的拷贝数，逡逑近似为２ｘｌ0３拷贝／以，即ＬＡＭＰ反应标准品的拷贝数为２ｘｌ０３拷贝／ｐＬ。逡逑Ｆｌｉａｏｒ？ｓｃS茫椋簦憷馘澹龋椋螅簦铮颍义希椋椋赍义希佩澹澹义希卞澹玻常矗担叮罚福瑰危保卞危保冲危郑峰澹保瑰危玻卞危玻冲危靛危玻峰危玻梗义希茫悖欤澹箦义贤迹玻保澹疲遥剩牛裕瘢校茫曳椒ǘ肯槠罚拢保常叮爸校拢蹋趾渴笛槔┰銮咄煎义希疲椋珏澹玻保澹裕瑁邋澹颍澹螅酰欤翦澹铮驽澹疲遥牛裕瘢校茫义澹恚澹簦瑁铮溴澹妫铮蝈澹拢蹋皱澹模危铃澹洌澹簦澹悖簦椋铮睿义希常插危蹋粒停蟹从σ锏纳杓棋义显谠な笛殄攵圆煌幕虺醪缴秆。缸椴煌囊铮溴恚玻持兴镜囊镥义峡诙∫猿晒椖康钠巍Ｆ渌橐锎嬖谝欢ㄈ毕荩械囊锢┰鲂式系停械囊镥义衔薹ń茇芎玫睦┰觯械囊镄枰缺湫缘某绦颉Ｔ谕瓿衫┰龇从Φ幕∩希诜从μ邋义舷靛尤牖芬铮估┰龇从σ切瑁矗靛澹恚椋罴纯赏瓿伞ｅ义希常冲危蹋粒停蟹从μ逑档慕㈠义希常常弊钍史从μ逑档娜范ㄥ义希常常保币锛浔壤挠呕义衔范ㄒ锛涞淖钣疟壤裕蹋粒停蟹从Ρ曜计肺０澹从μ逑瞪杓迫绫恚玻粗兴义鲜荆从崾笫勾ǎ玻ヅǘ惹碇悄航械缬炯觳狻ｅ义辖峁砻
本文编号：2799519
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