猪胸膜肺炎放线杆菌免疫保护性脂蛋白的筛选与鉴定
发布时间：2020-08-21 22:21
【摘要】：猪胸膜肺炎(Porcine pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪高度传染的呼吸道疾病。APP具有18种血清型及多种毒力因子。目前市场上常见的猪胸膜肺炎疫苗为灭活疫苗和亚单位疫苗,但都存在不同程度的缺陷:灭活疫苗交叉保护力不足,亚单位疫苗免疫保护性因子有限,不能完全排阻细菌定植和持续感染。因此,有待进一步了解APP的致病特点,发掘更具有免疫保护潜力的抗原,以便开发更为有效的疫苗。研究显示,多种APP外膜脂蛋白在APP各种血清型中较为保守,被认为是潜在的疫苗候选蛋白。本实验旨在筛选并鉴定APP免疫保护性强的脂蛋白,为开发高效亚单位疫苗奠定基础。现将研究过程和主要结论简述如下:1.脂蛋白克隆表达引物的设计:本实验在前期研究中,通过生物信息学方法,从APP血清3型菌株JL03中,筛选到60个可能的脂蛋白,并对脂蛋白Lip40和PaIA的生物学特性进行了分析。因此,本研究将对余下的58个脂蛋白的免疫活性进行详细分析。经过序列分析,通过合理地去除了脂蛋白信号肽序列,引入合适的酶切位点,设计了脂蛋白克隆表达的引物。2.脂蛋白原核表达载体的构建:以APP JL03菌株基因组为模板,通过PCR扩增出58个脂蛋白基因。将58个脂蛋白基因片段连入pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,鉴定正确后提取质粒,并双酶切出正确的脂蛋白基因片段,连入原核表达载体pGEX-KG,构建重组表达质粒。最终获得了 55个表达质粒。3.重组脂蛋白的表达、纯化及免疫反应性分析:将构建成功的55个脂蛋白重组表达质粒转化E.coli BL21菌株,IPTG诱导重组脂蛋白超量表达,共有47个脂蛋白基因能够在大肠杆菌中表达。其中37个重组脂蛋白为可溶性表达,10个重组脂蛋白为非可溶性表达。用亲和层析法,纯化37个可溶性重组脂蛋白,并通过免疫印迹法,鉴定蛋白的免疫反应性。经鉴定,共有31个重组蛋白具有免疫学活性。本研究从中筛选出免疫反应性较强的5个脂蛋白(APJL 0386,APJL 0922,APJL 1380,APJL 1740和APJL 1976),进行进一步分析。4.对小鼠的免疫保护性的鉴定:以筛选到的5个免疫学活性较好的脂蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,共免疫两次,然后用APP血清1型4074菌株对小鼠攻毒,以检验这5种脂蛋白的交叉保护作用。通过ELISA和WesternBlot检测小鼠体液免疫应答水平,发现各组免疫原能激发特异性免疫应答。APJL 1380、APJL 1976、APJL 0922、APJL 0386、APJL 1740对小鼠的保护率分别为92%、75%、75%、25%和42%。小鼠肺组织病理切片显示,以GST和PBS免疫的肺组织显示出动物急性和出血性肺炎病症,而免疫组中存活下来的小鼠显示出健康的肺切片。以主动免疫获得的免疫血清被动免疫BALB/c小鼠后,进行攻毒。针对蛋白质APJL_1380、APJL_1976、APJL_0922、APJL_0386和APJL_1740的抗血清对小鼠的保护率分别为83%、92%、67%、33%和25%。病理切片结果同主动免疫结果相似,抗脂蛋白血清组小鼠显示出健康的肺切片,而抗GST和PBS血清组显示出明显的肺部病变。通过本研究,从APP菌株中,筛选出APJL_0922、APJL_1380和APJL_1976这3个候选抗原,具有良好的免疫原性,能诱导动物产生高水平的体液免疫应答,且具有较高的免疫保护效力。这三个蛋白有望用于开发新的高效胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗,为猪胸膜肺炎的防控奠定基础。
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：
氨酸残基处通过酰胺连接脂肪酸［８９］。在酶切位点后第２、３、４处的氨基酸残基逡逑在Ｌｐｐ在革兰氏阴性菌的膜定位中起一定的作用。而脂蛋白在革兰氏阴性菌与阳性逡逑菌中的定位也有所不同［９（）］，具体见图１－１。逡逑a慑义舷犹宋ⅰ觥鲭鴍_ｗ湖概媒ｍｒ棚期逡逑Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ逦ｊ＾Ｂ逦ＰＧ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ逦Ｊ／ｋ逡逑ＣＭ逡逑嫌。ｗ媒撕嫌sEｗ媒济r>媒~枺髅絘义希危澹椋螅螅澹颍椋徨澹恚澹睿椋睿纾椋簦椋洌椋箦危拢铮颍颍澹欤椋徨澹猓酰颍纾洌铮颍妫澹颍殄危危澹椋螅螅澹颍椋徨澹恚澹睿椋睿纾椋簦椋洌椋箦义希牵危粒保梗矗跺危校玻插危牵危粒保福罚板义希迹拢惧濉鲥义希础焊鞅窼茫垮澹挡峰危酰义希校清危辏矗椋停椋荩欤辏㈠义希牵颍幔恚穑铮螅椋簦椋觯邋义希猓幔悖簦澹颍椋徨危校清义希茫湾危茫垮义吓锛ぁ鰚1■逦
本文编号：2799923
【学位授予单位】：华中师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：
氨酸残基处通过酰胺连接脂肪酸［８９］。在酶切位点后第２、３、４处的氨基酸残基逡逑在Ｌｐｐ在革兰氏阴性菌的膜定位中起一定的作用。而脂蛋白在革兰氏阴性菌与阳性逡逑菌中的定位也有所不同［９（）］，具体见图１－１。逡逑a慑义舷犹宋ⅰ觥鲭鴍_ｗ湖概媒ｍｒ棚期逡逑Ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ逦ｊ＾Ｂ逦ＰＧ逡逑ｂａｃｔｅｒｉａ逦Ｊ／ｋ逡逑ＣＭ逡逑嫌。ｗ媒撕嫌sEｗ媒济r>媒~枺髅絘义希危澹椋螅螅澹颍椋徨澹恚澹睿椋睿纾椋簦椋洌椋箦危拢铮颍颍澹欤椋徨澹猓酰颍纾洌铮颍妫澹颍殄危危澹椋螅螅澹颍椋徨澹恚澹睿椋睿纾椋簦椋洌椋箦义希牵危粒保梗矗跺危校玻插危牵危粒保福罚板义希迹拢惧濉鲥义希础焊鞅窼茫垮澹挡峰危酰义希校清危辏矗椋停椋荩欤辏㈠义希牵颍幔恚穑铮螅椋簦椋觯邋义希猓幔悖簦澹颍椋徨危校清义希茫湾危茫垮义吓锛ぁ鰚1■逦
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