基于RNA-Seq筛选抗绵羊肺炎支原体差异表达基因

发布时间：2020-08-22 00:36

【摘要】：目的:本研究选择巴什拜羊及盘羊杂交羊为实验动物,人工感染绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO),建立绵羊支原体肺炎病例模型,应用RNA-Seq技术对其进行高通量转录组测序分析,筛选相关的差异表达基因(Differently Expressed Genes,DEGs),为探析巴什拜羊和盘羊杂交感染MO的分子作用机制奠定基础。方法:(1)巴什拜羊与盘羊杂交羊对MO感染的比较:将6只巴什拜羊和6只盘羊杂交羊人工感染MO,分别观察其临床症状和病理解剖变化,用ELISA方法分别检测血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度,制作肺部组织切片,观察组织病理学变化,并用支原体肺炎动物模型的组织病理学评分系统进行组织病理学评分。(2)绵羊支原体肺炎病例模型的建立:巴什拜羔羊和盘羊杂交羔羊各9只,年龄2月,体重15-20kg,MO ELISA诊断试剂盒检测MO抗体均为阴性,用MO浓度约为CCU=10~6/mL,2 mL/只的剂量感染两种实验羊,每天记录观察临床表现并测量体温。采集感染MO后4d、14d实验羊的血液,分离血清,用MO ELISA诊断试剂盒再次检测MO抗体。(3)巴什拜羊,盘羊杂交羊肺组织转录组学研究:分别屠宰0d、MO感染4d、14d的巴什拜羊和盘羊杂交羊,设置3个生物学重复,迅速采集其肺组织,液氮保存送回实验室,提取RNA。使用IlluminaHiSeq~(TM) 2500平台进行高通量测序,P值0.05且Foldchange值2或0.667标准筛选差异表达基因、用GOseq R软件包进行Gene ontology(GO)富集分析和用KOBAS软件Kyoto encyclopoedia of genes and genomes(KEGG)富集分析。最后,再应用荧光定量PCR进行验证转录组测序结果。(1)通过以上方法对巴什拜羊感染MO前后进行转录组分析;(2)通过以上方法对盘羊杂交羊感染MO前后进行转录组分析;(3)以盘羊杂交羊为对照,巴什拜羊为实验组,通过以上方法对两种羊不同时间点肺组织进行比较转录组分析。结果(1)结果发现,感染后杂交羊比巴什拜羊表现出更严重的、典型的支原体肺炎的临床症状和病理解剖变化。组织病理学评分结果显示,杂交羊显著高于巴什拜羊。相关细胞因子检测结果发现,杂交羊的血清中IL-1β、IL-6、IL-9及IFN-γ的浓度均显著高于巴什拜羊。这说明巴什拜羊对MO感染具有一定的抗性,而杂交羊对MO较易感。(2)建立绵羊支原体肺炎病例模型的结果:巴什拜羊体温一过性升高,而盘羊杂交羊的体温则呈长时间较高幅度的升高。盘羊杂交羊在临床症状和病理解剖变化上表现出更典型,更严重的支原体肺炎的现象。在感染MO后所有实验羊的血清用MO ELISA诊断试剂盒检测MO抗体均为阳性。说明成功的建立了绵羊支原体肺炎病例。(3)转录组学分析结果。(1)巴什拜羊差异表达基因结果表明:巴什拜羊感染MO 4dpi和14dpi与0d相比较DEGs分别有1048个(上调575个,下调473个)和2823个(上调1362个,下调1461个);KEGG分析发现4dpi和14dpi与0d相比较的DEGs分别富集到245和287条通路中,其中与MO感染最密切相关的通路是TLR信号通路中(p=2.39 E-17),从富集到该通路图中的DEGs分布可以得出2条传导途径:第一条:MO LAMP-TLR2/TLR6-MyD88-MKK6-AP1-IL1B;第二条:MO LAMP-TLR8-MyD88-IRF5-RANTES。GO分析发现4dpi和14dpi与0d相比较的DEGs分别富集到1580和4561个条目中,经p值筛选发现其中与MO感染最密切相关的GO条目功能描述为积极调节炎症反应(p=1.27E-07)。(2)盘羊杂交羊差异表达基因结果表明:盘羊杂交羊感染MO 4dpi和14dpi与0d相比较DEGs分别有156个(上调44,下调112)和367个(上调35,下调332)。KEGG分析发现4dpi和14dpi与0d相比较的DEGs分别富集到109和150条通路中,其中与MO感染最密切相关的通路是免疫缺陷(p=2.98E-09)信号通路。GO分析发现4dpi和14dpi与0d相比较的DEGs分别富集到497和928个条目中,经p值筛选发现与MO感染最密切相关的GO条目功能描述为纤毛运动受损(p=1.72E-19),富集到该条目的DEGs包括:DNAH11、DNAI2、CFAP221、HYDIN和FOXJ1。(3)巴什拜羊和盘羊杂交羊差异表达基因结果表明:感染MO 4dpi和14dpi巴什拜羊与杂交羊相比较DEGs分别有212个(上调146,下调66)和311个(上调158,下调153)。结合GO和KEGG分析,我们发现在感染的肺组织的转录组数据中存在几个与MO感染相关的有意思的DEGs,包括SPLUC1(BPIFA1)、SP-A(SFTPA-1)、P2X7R、DQA、SOSC1、HO-1(HSP32)、NF-κB、NF-E2、AID、CD19和BAFFR。结论:本研究筛选出11个差异表达基因和相关信号通路将为分析巴什拜羊和盘羊杂交感染MO的分子作用机制奠定了基础。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.26
【图文】：

肺部,出血点,表面

肺脏组织病理学观察结果，A 组巴什拜羊表现为轻度病变，肺组织结构清晰，野肺间质增宽，其间有淋巴细胞、巨噬细胞及淡粉色渗出液浸润。细支气管上皮排则，管腔的周围有少量炎症细胞浸润（图 1-2A）。B 组杂交羊均表现重度病变，其围广泛，大部分视野可见肺间质明显变宽，压迫肺间质致使连成片，肺泡腔消失，有大量淋巴细胞浸润，细支气管上皮破坏，脱落，管腔内有明显渗出，肺间质毛细支气管旁小静脉淤血突出（图 1-2B）。对两个组绵羊肺部组织病理学评分，结果 A 分为 9.4，B 组平均分 19.9，B 组评分显著高于 A 组（P<0.05）。

出血斑,出血点

羊肺,出血点,肺部

图 1-1B 严重的肉变、肝变、出血点和出血斑Fig1B. serious change of meat , liverdegeneration, hemorrhage points and bleedingspots图 1-1A 肺部表面有轻微出血点Fig1A. The lungs surface of minor bleedingspots肺脏组织病理学观察结果，A 组巴什拜羊表现为轻度病变，肺组织结构清晰，局野肺间质增宽，其间有淋巴细胞、巨噬细胞及淡粉色渗出液浸润。细支气管上皮排列则，管腔的周围有少量炎症细胞浸润（图 1-2A）。B 组杂交羊均表现重度病变，其病围广泛，大部分视野可见肺间质明显变宽，压迫肺间质致使连成片，肺泡腔消失，间有大量淋巴细胞浸润，细支气管上皮破坏，脱落，管腔内有明显渗出，肺间质毛细血支气管旁小静脉淤血突出（图 1-2B）。对两个组绵羊肺部组织病理学评分，结果 A 组分为 9.4，B 组平均分 19.9，B 组评分显著高于 A 组（P<0.05）。

【参考文献】