CircEZH2靶向miR-22抑制TGEV诱导的线粒体损伤作用与机制研究

发布时间：2020-08-22 01:39

【摘要】：猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、接触性传染病,TGEV可引起仔猪肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cell,IPEC)发生变性、死亡,造成肠管水、电解质代谢紊乱,营养吸收障碍,从而引起仔猪腹泻、脱水、营养流失,甚至死亡。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微小RNA(microRNA,miRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等,在细胞新陈代谢、线粒体损伤以及病毒感染等生理和病理过程中发挥重要调控作用。线粒体是维持细胞正常代谢以及营养吸收功能的关键细胞器之一,前期研究发现,TGEV感染可诱导猪肾细胞PK-15(porcine kidney cell PK-15,PK-15)线粒体肿胀、破裂、功能异常。然而,TGEV是否同样可以诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤,以及在此过程中miRNA和circRNA表达谱的变化情况及调控机制至今尚未见报道。本论文首先建立TGEV感染猪空肠黏膜上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell-jejunum 2,IPEC-J2)诱导细胞线粒体损伤模型,然后采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术检测TGEV感染后IPEC-J2细胞miRNA和circRNA表达谱的变化,预测、筛选与线粒体相关的miRNA和circRNA。最后利用实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、免疫印迹(western blot,WB)、双荧光素酶报告基因(dual luciferase reporter,DLR)分析、流式细胞术(flow cytometry,FCM)等方法研究miRNA和circRNA在TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中的调控作用及机制。研究取得以下结果。1.TGEV感染新生仔猪,48 h后采集仔猪空肠组织,病理组织学检查结果发现,TGEV感染的仔猪空肠壁变薄,肠腔扩张,IPEC细胞变性、死亡,绒毛脱落、变短;电镜检查结果显示,TGEV感染后,IPEC细胞线粒体肿胀、破裂、嵴断裂、数量减少。1.0 MOI TGEV体外感染IPEC-J2细胞24 h,电镜检查发现,IPEC-J2细胞线粒体肿胀、破裂、嵴断裂。使用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜及多功能微孔板检测仪检测发现,细胞内线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)异常开放(p0.01);活性氧(reactive oxygen,ROS)水平升高(p0.01);线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)降低(p0.01)。2.利用RNA-seq技术检测TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中miRNA表达谱的变化,筛选得到65个差异表达的miRNAs(fold change≥1.5,FDR≤0.05),其中46个miRNAs表达量上调,19个miRNAs表达量下调。采用RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v6.01)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version:7.0)3种算法预测差异表达miRNAs的靶基因,得到3088个靶基因。对3088个靶基因进行KEGG富集分析,发现差异表达的miRNAs主要富集于代谢(metabolic pathways)、二次代谢产物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)等通路中;对3088个靶基因进行GO富集分析,发现其中有58个miRNAs对应的286个靶基因定位于线粒体,其中known miRNAs有15个。3.利用RNA-seq技术检测TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中circRNA表达谱的变化,筛选得到123个差异表达的circRNAs,其中69个circRNAs表达量上调,54个circRNAs表达量下调(fold change≥2,FDR≤0.05)。利用Mireap(v0.2)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version7.0)和StarBase数据库,分析差异表达circRNAs与线粒体相关差异表达miRNAs种子序列结合情况,并通过差异表达circRNAs与miRNAs表达量的负相关性筛选得到与线粒体相关miRNAs存在调控关系的10个circRNAs。qRT-PCR验证circRNAs表达量的变化,结果与RNA-seq一致。4.根据生物信息学分析结果,筛选差异表达较大、与线粒体相关的miR-22作为研究对象,研究其在TGEV诱导线粒体损伤过程中的作用机制。用miR-22 mimics和miRNA inhibitor过表达和沉默miR-22,检测miR-22对mPTP、ROS及MMP的作用,发现miR-22促进TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p0.01)、ROS积累(p0.01),降低MMP(p0.05);预测miR-22靶基因,筛选得到与线粒体相关的15个靶基因,采用双荧光素酶试验和WB试验验证miR-22靶基因,证实HK2是miR-22靶基因。用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默HK2,检测mPTP异常开放情况、细胞内ROS水平以及MMP,结果显示,沉默HK2促进TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p0.01)、ROS积累(p0.01)及MMP下降(p0.05)。5.根据生物信息学预测结果结合双荧光素酶试验验证得到circEZH2与miR-22具有结合能力,FISH试验发现,circEZH2和miR-22可共同定位在细胞质中。构建pcircRNA-circEZH2质粒,并设计合成circEZH2的siRNA,分别转染IPEC-J2细胞,并感染TGEV,检测circEZH2对mPTP的作用,发现circEZH2抑制TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p0.01),ROS积累(p0.05)和MMP下降(p0.05)。为了证明circEZH2是通过吸附miR-22调控TGEV诱导的线粒体损伤过程,将pcircRNA-circEZH2和miR-22 mimics con(或pcircRNA-circEZH2和miRNA mimics con)转染到IPEC-J2细胞,然后感染TGEV,检测细胞mPTP异常开放情况,结果证实,miR-22能够阻断pcircRNA-circEZH2对TGEV诱导IPEC-J2细胞mPTP异常开放、ROS积累、MMP下降的抑制作用(p0.05)。本研究首先证实了TGEV诱导IPEC-J2细胞mPTP异常开放、ROS水平升高、MMP降低,造成线粒体肿胀、破裂、嵴断裂,成功构建了TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤模型。进而通过RNA-seq技术检测到TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中有65个miRNAs和123个circRNAs差异表达,并通过靶基因预测和生物信息学分析筛选得到了线粒体相关known miRNAs有15个,通过比对circRNA上的miRNA应答元件(microRNA response elements,MREs)结合circRNA的组成情况预测得到10个circRNAs与线粒体相关known miRNAs具有结合能力。根据生物信息学分析结果,筛选差异表达较大、与线粒体相关的miR-22作为研究对象,并通过双荧光素酶及FISH试验证实circEZH2与miR-22结合。最后,采用一系列实验室手段阐明了circEZH2通过吸附miR-22促进HK2翻译过程,抑制TGEV诱导的线粒体损伤的作用机制。研究结果为进一步揭示TGEV致病机制提供理论依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

图 3-1 TGEV N 基因 PCR 电泳结果箭头代表 PCR 产物位置（150 bp） Electrophoretic results of PCR for N genes represent the location of PCR production仔猪空肠病变片制作方法，结合 HE 染色法，制描仪观察并记录 TGEV 感染组及 ck 组相比，TGEV 感染的仔猪空肠图 3-2）。

图 3-1 TGEV N 基因 PCR 电泳结果箭头代表 PCR 产物位置（150 bp）Fig. 3-1 Electrophoretic results of PCR for N gene of TGEVArrows represent the location of PCR production (150 bp)V 感染诱导仔猪空肠病变织常规石蜡切片制作方法，结合 HE 染色法，制作仔猪空肠组字病理切片扫描仪观察并记录 TGEV 感染组及 Mock 组空肠组显示，与 Mock 组相比，TGEV 感染的仔猪空肠壁变薄，IPEC脱落、变短（图 3-2）。

图 3-3 透射电子显微镜结果ock 组 IPEC-J2 细胞线粒体超微结构；B：体外试验 TGEV 感染组C：体内试验 Mock 组空肠黏膜上皮细胞线粒体超微结构；D：体膜上皮细胞线粒体超微结构；箭头所指为线粒体；三角所指为 TGFig. 3-3 The result of transmission electron microscopeUltrastucture of mitochondria in IPEC-J2 of Mock group in vitro; B: Ultn IPEC-J2 of TGEV infected group in vitro; C: Ultrastucture of mitocho vivo; D: Ultrastucture of mitochondria in IPEC of TGEV infected grouppoints to mitochondrion; triangle points to viral particle 诱导 IPEC-J2 细胞 mPTP 异常开放cellProbeTM M61 mPTP 检测试剂盒检测原理是利用荧e RecoveryAfter Photobleaching，FRAP）技术进行检测。首lProbeTM M61 探针，BBcellProbeTM M61 探针是一种对活色试剂，它其实是在钙黄绿素（Calcein）中插入了乙酰甲氧

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 宋寒;田璐瑶;王丽;董伟;袁們;杨舟;宋振辉;;一株仔猪肠道益生菌的鉴定及其体外抗TGEV增殖的初步研究[J];黑龙江畜牧兽医;2017年17期

2 王劭;朱小丽;朱晓琳;陈少莺;林锋强;陈仕龙;程晓霞;李兆龙;江斌;;猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)福建分离株核衣壳蛋白基因(N)的克隆与表达分析[J];农业生物技术学报;2013年01期

3 房红莹;窦守强;罗满林;;猪呼吸道冠状病毒研究进展[J];中国畜牧兽医文摘;2007年06期

4 吴国平,尹燕博,吴时友;猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)研究进展[J];中国兽医杂志;2003年02期

5 查红波;猪呼吸道冠状病毒感染[J];中国动物保健;2003年11期

6 陈正贤;猪呼吸道冠状病毒[J];动物检疫;1993年03期

7 朱蕴暖;张鑫;朱向东;陈建飞;时洪艳;石达;王鑫;季朝阳;冯力;;猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立[J];中国兽医科学;2017年01期

8 修晶辉;李伟娜;尹鑫;刘宁;魏萍;;一株仔猪肠道益生菌抗TGEV作用初探[J];黑龙江畜牧兽医;2012年03期

9 ;Complete Genomic Sequence of Transmissible Gastroenteritis Virus TS and 3' End Sequence Characterization Following Cell Culture[J];Virologica Sinica;2010年03期

10 王劭;陈少莺;林锋强;程晓霞;江斌;陈仕龙;林琳;朱小丽;;猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2007年11期

相关会议论文 前10条

1 邹勇;周燕;王建超;华平;何锡忠;苏万国;唐永兰;钱永清;;应用微载体技术生产TGEV试验研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

2 Wang li;Dai xianjin;Song han;Zhou yue;Ye cuifang;Hu yang;Song zhenhui;;Construction of recombinant baculovirus expressing TGEV spike protein S2 and the preliminary research of its immunogenicity[A];第七届中国畜牧科技论坛论文集[C];2016年

3 张小波;左玉柱;刘媛;范京惠;李潭清;李建辉;孙彦新;;猪传染性胃肠炎病毒M蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

4 王劭;陈少莺;林锋强;程晓霞;江斌;陈仕龙;林琳;朱小丽;;猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用[A];福建省科协第七届学术年会分会场——“坚持科技创新，建设海西现代畜牧业”研讨会论文集[C];2007年

5 李娜;黄小波;曹三杰;文心田;;猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会论文集[C];2008年

6 Dai xianjin;Ye cuifang;Li yuntian;Wang li;Hu yang;Song zhenhui;;Morphogenesis and Proliferative Rule of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus in SIEC[A];第七届中国畜牧科技论坛论文集[C];2016年

7 杨百亮;冯力;赵翠萍;孙东波;张建斌;;抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年

8 孙东波;冯力;刘杰;时洪艳;佟有恩;刘胜旺;童光志;;猪传染性胃肠炎病毒n基因的原核表达及重组蛋白的免疫活性分析[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集[C];2008年

9 黄小波;曹三杰;文心田;;猪传染性胃肠炎病毒检测基因芯片的初步构建[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会第六届代表大会论文集[C];2006年

10 Yu-Bei Jin;Wen-Tao Yang;Chun-Wei Shi;Bo Feng;Gui-Lian Yang;Chun-Feng Wang;;Immune responses induced by recombinant Lactobacillus plantarum expressing the spike protein derived from transmissible gastroenteritis virus in piglets[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十三次全国学术研讨会论文集[C];2018年

相关博士学位论文 前10条

1 马雪连;CircEZH2靶向miR-22抑制TGEV诱导的线粒体损伤作用与机制研究[D];西北农林科技大学;2019年

2 李训良;猪IL-12与TGEV S1核酸疫苗联合免疫保护效果研究[D];东北农业大学;2018年

3 薛美;内质网应激调控猪传染性胃肠炎病毒复制的分子机制[D];中国农业科学院;2019年

4 牟春晓;表达TGEV S蛋白的重组靶向枯草芽孢杆菌增强猪黏膜免疫机制的研究[D];南京农业大学;2017年

5 朱向东;TGEV强弱毒株的反向遗传系统及报告病毒的构建[D];中国农业科学院;2017年

6 胡晓亮;猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制[D];东北农业大学;2015年

7 王雪飞;中药复方体外抗TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的机制研究[D];内蒙古农业大学;2016年

8 胡唯伟;TGEV利用表皮生长因子受体调控肠上皮细胞微丝骨架及其入胞机制的研究[D];南京农业大学;2016年

9 兰喜;猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究[D];中国农业科学院;2006年

10 彭树英;TGEV S基因的克隆、表达及转基因小鼠的制备[D];西北农林科技大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 张海燕;PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究[D];华中农业大学;2019年

2 LANA BOUKARROUM;[D];华中农业大学;2019年

3 李家威;p53对TGEV诱生IFN-β的调控作用及其分子机制研究[D];海南师范大学;2019年

4 王一鹏;TGEV单克隆抗体及抗原检测胶体金试纸条的制备[D];河北农业大学;2019年

5 王凯;基于JAK-STAT1信号通路探讨植物乳杆菌上清抗TGEV感染的机制[D];西南大学;2019年

6 杨洋;基于SGLT1介导的p-38MAPK/AKt2信号通路探讨TGEV感染对NHE3易位的影响与机制[D];西南大学;2019年

7 戴磊;TGEV感染对猪肠上皮细胞葡萄糖和精氨酸吸收影响机制的研究[D];南京农业大学;2017年

8 王晓青;枯草芽孢杆菌及其表面活性素抑制TGEV入侵猪肠上皮细胞的初步探究[D];南京农业大学;2017年

9 王洪微;猪传染性胃肠炎病毒M蛋白诱导IFN-β表达分子机制及功能域研究[D];东北农业大学;2019年

10 单玲玲;原核表达猪IFN-γ抑制猪传染性胃肠炎病毒的复制及相关机制的研究[D];中国农业科学院;2019年

本文编号：2800105