Mo感染诱导不同品种羊TLRs及其通路因子表达差异性研究

发布时间：2020-08-22 02:22

【摘要】：绵羊肺炎支原体(Mo)是羊支原体肺炎的主要病原,以3月龄山羊和绵羊最为易感,患羊肺部发生纤维素性渗出炎症为主要特征。不同品种羊对羊支原体肺炎易感性存在差异,分析认为与不同品种羊免疫反应存在相关关系。Toll样受体(TLRs)是机体重要的免疫相关分子,主要分布于上皮细胞、免疫细胞等,通过识别病原相关分子模式,将信号沿着MyD88途径或TRIF途径进行传递,调控NF-?B、AP-1等分子转录,最终启动免疫细胞增殖和炎性细胞因子表达,帮助机体抵御和清除病原体。然而不可控的炎症反应,将会造成机体组织损伤。本研究在分析不同种羊(黑山羊、白山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊)Toll样受体基因及表达多态性基础上,通过Mo人工感染5种羊,以典型病变组织样本肺脏和全身性炎症样本血液为研究对象,采用TaqMan实时荧光定量PCR方法,从TLR1-10基因含量水平、TLR1-10基因转录水平、MyD88和TRIF信号通路重要接头分子转录水平探讨不同品种羊感染Mo后,Toll样受体及其通路因子表达差异性,为研究Toll样受体与支原体肺炎易感性关系奠定基础性研究资料。1.Mo感染不同品种羊TLRs基因水平差异性研究5种实验羊进行Mo人工感染显示不同品种羊Mo感染后病程、死亡率和炎症水平存在差异,其中死亡率从高到低依次为白山羊、黑山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊,其中湖羊和各对照组均无死亡。采集实验组血液样本122份、肺脏样本25份进行TLR1-10基因定量检测与分析。实验羊肺脏样本TLRs基因定量检测分析显示,同种羊感染组肺组织中TLR2/4/5/6/8/9基因含量显著高于对照组(P0.05),而TLR3/7/10感染组与对照组差异不显著(P0.05);各品种羊感染组肺组织中TLR1基因含量与对照组相比存在种间差异。种内比较结果提示TLRs参与Mo感染过程,且存在种间差异。不同种羊感染组肺组织中TLR1-10基因含量差异性分析显示,白山羊肺组织中TLR2基因含量极显著高于黑山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01),黑山羊TLR10基因含量极显著高于白山羊、麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01),黑山羊、白山羊TLR6和TLR8基因含量极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01),麻羊、波尔山羊TLR4/5基因和湖羊TLR5基因含量极显著高于白山羊和黑山羊(P0.01)。种间比较结果提示TLR2/4/6/8可能参与黑山羊、白山羊、麻羊感染早期炎症的快速发展并导致死亡。不同种羊血液样本TLRs基因定量检测分析显示,同种羊不同时段血液样本中感染组TLR1/2/4/6/10含量高于对照组,感染组TLR3/9含量与对照组、感染组不同时段并无显著性差异;黑山羊TLR5、湖羊TLR7在感染组与对照组之间无明显差异。种内比较提示,TLRs能参与全身炎症的发生发展,不同品种羊在TLR5/7/8存在差异。5种羊TLR1/2/4/5/6在感染0 h无显著性差异(P0.05),麻羊、波尔山羊和湖羊感染48 h和96 h血液样本TLR1基因含量显著高于黑山羊和白山羊(P0.01);黑山羊和白山羊48和96 h血液TLR2基因、黑山羊和白山羊96 h血液TLR4基因含量极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01);白山羊和波尔山羊96 h血液TLR6基因极显著高于黑山羊、麻羊和湖羊。血液样本分析结果提示TLR1/2/4/6参与各品种羊全身性炎症过程,其中TLR1水平可能与实验羊血液炎症发生呈负相关,而TLR2/4/6与炎症发展呈正相关。2.Mo感染不同品种羊TLRs转录水平差异性研究应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本TLR1-10转录水平检测分析。实验羊肺脏样本中TLRs基因转录水平分析显示,各种羊感染组肺脏组织中TLRs基因转录水平均显著高于对照组(P0.05)。黑山羊、白山羊肺组织中TLR1/2/4/5/6/8/9基因转录水平高于TLR3/7/10,而麻羊、波尔山羊、湖羊肺组织中TLR4/5/7/8基因转录水平高于TLR1/2/3/6/9/10。种内比较结果提示,TLRs转录水平与基因含量水平呈现相似结果,与炎症进程存在相关关系。不同种羊肺脏样本TLRs基因转录水平分析显示,黑山羊、白山羊肺组织中TLR1/2/9转录水平显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.05),白山羊肺组织中TLR6、湖羊肺组织中TLR4转录水平较其它品种羊最高(P0.01);波尔山羊肺组织TLR5/7/10转录水平最高(P0.01)。种间比较结果提示,TLRs转录水平参与调控羊支原体炎症进程存在种间差异。实验羊血液样本中TLR1-10转录水平分析显示,同种羊感染Mo 48 h和96 h血液样本TLR1/2/4/6/7/8基因转录水平高于0 h和对照组;麻羊、波尔山羊、湖羊感染组TLR3基因转录水平高于对照组;麻羊感染组TLR10转录水平显著高于对照组。种内比较结果,提示各品种TLR1/2/4/6/7/8普遍参与全身性炎症反应,而TLR3/5/9/10存在种间差异。各种羊感染组间各时段TLR5/9无显著差异;0 h、48 h感染组血液样本TLR1基因转录水平种间差异不显著(P0.05),湖羊96 h血液中TLR1转录水平显著高于其余品种羊(P0.05);黑山羊、白山羊、波尔山羊和湖羊感染组48 h、96 h时TLR4转录水平极显著高于麻羊(P0.01);白山羊感染组48 h和96 h时TLR6转录水平极显著高于其余4种羊(P0.01);白山羊、波尔山羊感染组不同时间TLR7基因转录水平均极显著高于黑山羊、麻羊和湖羊;白山羊和黑山羊感染组48 h和96 h时TLR8基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊。种间比较结果提示TLR1在转录水平负调控炎症进程,TLR2/4/6/7/8转录参与调控炎症进程存在种间差异。3.Mo感染不同品种羊TLRs MyD88通路因子转录水平差异性研究应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本进行TLRs MyD88通路因子转录水平检测分析。结果显示,5种羊感染组肺组织MyD88、TRAF6、NF-кB、FOS、JUN基因转录水平均极显著高于对照组(P0.01);种间差异性分析显示,白山羊肺组织NF-кB基因转录水平极显著高于其余4种羊(P0.01);黑山羊、白山羊肺组织FOS基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01);JUN基因转录水平种间差异不显著(P0.05)。实验羊肺组织MyD88通路因子转录水平差异性分析提示,Mo感染可激活TLRs MyD88通路促进炎症反应,其中白山羊、黑山羊反应强烈。血液样本MyD88、TRAF6、NF-кB、FOS、JUN基因转录水平差异性分析显示,5种羊感染组极显著高于对照组(P0.01),同时感染48、96 h各基因转录水平均高于0 h。黑山羊和白山羊感染组各时段MyD88、TRAF6、FOS转录水平均极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01)。5种羊感染组NF-кB基因转录水平0 h-96 h间持续升高,种间无显著性差异(P0.05);5种羊感染组JUN基因各时段均差异不显著(P0.01)。血液样本MyD88通路因子转录水平差异性分析提示,Mo感染可激活TLRs MyD88通路促进炎症反应,5种羊TLRs/MyD88/NF-кB通路存在差异,以黑山羊、白山羊表现更为强烈。4.Mo感染不同品种羊TLRs TRIF通路因子转录水平差异性研究应用TaqMan实时荧光定量检测方法对5种羊25份肺脏样本和126份血液样本TLRs TRIF通路因子转录水平检测分析显示,5种羊感染组肺组织中TRIF、TRAF3、IRF3、IRF7极显著高于对照组(P0.01);种间差异性分析显示,TRIF、TRAF3基因种间彼此差异显著(P0.05),麻羊肺组织IRF3基因转录水平最高(P0.01);黑山羊、白山羊肺组织IRF7转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊(P0.01)。TRIF通路因子转录水平差异性分析提示,Mo感染可启动羊TLRs TRIF信号通路,其中以黑山羊、白山羊最为明显。5种羊感染组血液样本TRIF、IRF3、IRF7基因转录水平极显著高于对照组(P0.01),且感染48 h和96 h时转录水平均高于0 h;种间差异性分析显示,黑山羊、白山羊感染组96 h时TRIF基因转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊、湖羊(P0.01);麻羊感染组48 h和96 h时IRF3基因转录水平极显著高于黑山羊、白山羊、波尔山羊和湖羊(P0.01);黑山羊、白山羊感染组48 h、96 h时IRF7转录水平极显著高于麻羊、波尔山羊和湖羊。血液样本TRIF通路因子转录水平差异性分析提示,Mo感染激活TLRs TRIF通路,黑山羊、白山羊表现强烈。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.26;S858.27
【图文】：

设计的 TLR1-10 基因的引物能从羊 DNA段大小相符。因重组质粒 PCR 鉴定结果 TLR1-10 基因和β-actin 内参基因重组质粒为模 2.2.2.1 的反应体系对重组质粒进行 PCR 鉴定，10M 1 2 3 45 6 7 8 9 11图 1-1 目的基因 PCR 扩增结果00 Marker ;1:TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR68:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actinFig.1-1 PCR Amplification of target gene0 Marker ;1TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR6;8:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actin500 bp100 bp151131250 bp

设计的 TLR1-10 基因的引物能从羊 DNA大小相符。组质粒 PCR 鉴定结果LR1-10 基因和β-actin 内参基因重组质粒为模2.2.1 的反应体系对重组质粒进行 PCR 鉴定，10ppM 1 2 3 41985 6 7 8 9 11图 1-1 目的基因 PCR 扩增结果arker ;1:TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR68:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actinFig.1-1 PCR Amplification of target genearker ;1TLR1;2:TLR2;3:TLR3;4:TLR4;5:TLR5;6:TLR6;8:TLR8;9:TLR9;10:TLR10;11:β-actin

表 1-4 羊 TLR1-10 和β-actin 标准曲线基本信息Table.1-4 The basic information of TLR1-10 and β-actin standard curve基因名称Genes扩增效率%E Values相关系数R2Values斜率SopeY 轴截距Y-Axis线性方程Linear equationTLR1 103 1 -3.28 44.98 Ct=-3.28lnX+44.98Number 1-7:TLR1-10 gene recombinant plasmid diluted from 1.0×109copies/μL-1.0×103copies/μL;图 1-3 羊 TLRs 基因 qPCR 扩增曲线（A）和回归曲线（B）ig.1-3 The result of qPCR amplification of curve（A）and regression curve（B）of sheep TLRs gene1 2 3 4 5 6 7A7654321BNumber 1-7:β-actin gene recombinant plasmid diluted from 1.0×109copies/μL-1.0×103copies/μL;图 1-4 羊β-actin 基因 qPCR 扩增曲线（A）和回归曲线（B）Fig.1-4 The result of qPCR amplification of curve（A）and regression curve（B）of sheep β-actin gene

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本文编号：2800143