没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟影响及其作用机制研究

发布时间：2020-08-23 13:10

【摘要】：卵母细胞体外成熟是体外辅助生殖技术中重要的一步,然而体外环境因素,比如氧气浓度等,制约卵母细胞的体外成熟质量。没食子酸(Gallic Acid,GA)是一种广泛存在于界植物中的有机酸,研究发现,其具有很强的抗氧化能力,能够帮助细胞清除自由基,起到保护细胞的作用。但是目前尚未有研究报道关于没食子酸对生殖细胞的保护作用,而且关于没食子酸的作用机制鲜有报道。因此,本研究通过探讨没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟及其后续IVF胚胎发育的影响,同时研究其可能的作用机制,为进一步完善黄牛卵母细胞体外成熟体系提供理论依据。首先探讨了没食子酸对黄牛卵母细胞体外成熟及其后续IVF胚胎发育的影响。黄牛卵丘卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes,COCs)在添加有不同浓度(0、10、30、50、100 μmol/L)没食子酸的体外成熟液(M液)中培养22-24 h后,统计卵丘细胞扩展情况及卵母细胞的第一极体排出率;随后,将成熟培养后的卵母细胞进行体外受精(In Vitro Fertilization,IVF),分别统计早期胚胎的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数及囊胚细胞凋亡率。结果显示,M液中添加30 μmol/L浓度GA组的卵丘细胞扩展分值和卵母细胞第一极体排出率显著高于0 μmol/L对照组(P0.05),其他处理组与对照组无显著性差异(P0.05);随后,IVF胚胎发育结果显示,各处理组的胚胎卵裂率和囊胚率与对照组相比均有所提高,其中30 μmol/L组的卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数均显著高于0 μmol/L对照组(P0.05),但是其囊胚细胞凋亡率与0 μmol/L对照组相比差异不显著(p0.05)。其次根据各浓度没食子酸的处理效果,选择了 30μmol/L GA处理黄牛COCs 22-24 h,探讨了其可能作用的机制。结果发现:相比0μmol/L对照组,30 μmol/L的GA处理可以显著降低卵母细胞内活性氧的荧光强度(16.65±4.03 VS 10.80±3.36,p0.05);对抗氧化酶检测发现,30 μmol/LGA可以显著提高卵母细胞内总谷胱甘肽含量(0.00498±0.00091 VS 0.00777±0.0010 pmol/oocyte,P0.05)和过氧化氢酶水平(0.51726667±0.845 VS 1.169166654±0.845 U/mg蛋白,P0.05)。对NF-κB信号通路分析发现,GA引起的黄牛卵母细胞内活性氧水平下降会减弱对NF-κ B信号通路的刺激,并显著性降低了卵母细胞内NF-κB mRNA和蛋白的表达水平(p0.05)。而结合荧光定量PCR发现NF-κ B信号通路受到抑制后可能促进了下游超氧物歧化酶1(Superoxide Dismutasel,SOD1)和谷胱甘肽过氧化酶4(Glutathio ne Peroxidase 4,GPX4)等抗氧化酶基因的mRNA 表达(p0.05)。此外,探讨了黄牛COCs体外成熟过程中,没食子酸对卵丘细胞的影响。结果发现,相比0 μmol/L未处理组,30 μmol/LGA也可以显著性降低卵丘细胞内活性氧水平和显著性提高总谷胱甘肽及过氧化氢酶含量(p0.05)。荧光定量结果显示,30 μmol/L处理组的卵丘细胞内促凋亡基因(Bax、Bad)mRNA表达受到了抑制,而卵丘扩展基因(PTGS2/PTX3/HAS2F/TSG6)、抗凋亡基因(Bc12)、增殖基因(spyl/spy2/spy3)及抗氧化基因(GPX4和SOD1)mRNA表达得到了显著提高(p0.05)。最后,探讨了没食子酸对黄牛卵母细胞内线粒体含量的影响。荧光定量PCR和细胞免疫荧光结果显示,黄牛卵母细胞成熟阶段,30 μmol/L没食子酸的处理可以显著提高线粒体转录因子PGC-1 α、TFAM、UCP2 mRNA的转录和线粒体转录因子TFAM蛋白的翻译(P0.05),促进了线粒体的生物合成。上述结果表明:(1)体外成熟液中添加30 μmol/L没食子酸可以促进黄牛卵母细胞的成熟质量及其后续胚胎的发育;(2)没食子酸促进卵母细胞成熟可能是通过以下途径发挥作用:α,清除细胞内活性氧,抑制活性氧引起的NF-κB信号通路激活,提高自身抗氧化系统的抗氧化能力;b,没食子酸可以促进卵丘细胞增殖、扩展,降低卵丘细胞凋亡,维持其正常生理功能状态,进而促进卵母细胞成熟;c,没食子酸可以促进卵母细胞内线粒体的生物合成,提高卵母细胞成熟质量。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823.81
【图文】：

１０．邋８０±３．邋３６，Ｐ＜０．邋０５）。逡逑°，鲁逦５５ＢＢ｜１５．邋丁逡逑图２－１细胞内活性氧含量检测；图２－１Ａ，卵母细胞明场光与ＲＯＳ荧光图；图２－１Ｂ，活性氧相对荧光强度逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邋ＲＯＳ；邋Ｆｉｇ２－１Ａ，邋Ｂｒｉｇｈｔ邋ｆｉｅｌｄ邋ｌｉｇｈｔ邋ａｎｄ邋ＲＯＳ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｏｏｃｙｔｅ；逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１Ｂ，邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｎ邋ｓｐｅｃｉｅｓ逡逑＊注：不同字母标注代表差异显著（户＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（尸＜０．０５）．逡逑３４逡逑

逑／逦／逡逑图２－３卵母细胞过氧化氢酶含量（单位：Ｕ／ｍｇ蛋白）逡逑Ｆｉｇ２－３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｃａｔａｌａｓｅ邋ｉｎ邋ｏｏｃｙｔｅ邋（ｕｎｉｔ：邋Ｕ／ｍｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ）逡逑＊注：不同字母标注代表差异显著（Ｐ＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（＾＜０．０５）．逡逑３５逡逑

逡逑图２－２卵母细胞内总谷胱甘肽含量（单位：ｐｍｏｌ／卵母细胞）逡逑Ｆｉｇ２－２邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ＧＳＳＧ邋ａｎｄ邋ＧＳＨ邋ｉｎ邋ｏｏｃｙｔｅ邋（ｕｎｉｔ：邋ｐｍｏｌ／ｏｏｃｙｔｅ）逡逑＊注：不同字母标注代表差异显著（Ｐ＜０．邋０５）。逡逑＊Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅｒｅ邋ａｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒ邋ｍａｒｋｓ邋（Ｐ＜０．０５）．逡逑２．邋３成熟液中添加没食子酸对黄牛卵母细胞内过氧化氢酶含量影响逡逑根据前面不同ＧＡ浓度处理处理效果，选择３０邋Ｗｎｏｌ／Ｌ邋ＧＡ处理未成熟的黄牛逡逑ＣＯＣｓ邋２２－２４ｈ后，检测卵母细胞内过氧化氢酶水平，结果发现：相比对照组，ＧＡ逡逑可以显著提高细胞内过氧化氢酶水平（０．５１７２６６６７±０．邋８４５邋ＶＳ邋１．１６９１６６６５４邋士逡逑０．８４５邋Ｕ／ｍｇ邋蛋白，Ｐ＜０．邋０５）；逡逑１．５－１逡逑Ｃ３０逡逑＾逦ａ逡逑；＝＞逦—－Ｉ逡逑＿邋１．０＿逡逑＞0

【参考文献】

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1 吴柱连;刘晓华;杜凤娇;雷钏;尹娜;郭振伟;屈春凤;刘晓淋;阮秋燕;陆凤花;石德顺;;表儿茶素对小鼠卵母细胞mtDNA拷贝数和胚胎体外发育能力的影响[J];中国畜牧兽医;2015年04期

2 乔利敏;黄成定;李向臣;姚雅馨;关伟军;马月辉;;卵母细胞体外成熟的影响因素[J];上海畜牧兽医通讯;2008年05期

3 殷骏;张晋平;杨勇;;不同培养时间对猪卵母细胞体外成熟效果的影响[J];畜牧与饲料科学(奶牛版);2006年06期

4 张伟,王利红;影响卵母细胞体外成熟的因素[J];黄牛杂志;2005年01期

5 王艳军,梁冠生,刘健,张嘉保;牛性机能发育阶段与卵泡、黄体因素对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响[J];黑龙江动物繁殖;2000年02期

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本文编号：2801565