利用CRISPR-Cas9技术缺失UL23、US10基因重组鸭瘟病毒的构建

发布时间：2020-08-24 13:39

【摘要】：鸭瘟是由鸭瘟病毒(DPV)引起的禽类的一种急性、热性、败血性传染病。CRISPR-Cas9系统是一种基因编辑技术,CRISPR相关蛋白9能对目的基因片段进行准确切割。本研究以DPV的UL23以及US10基因为靶点,通过特定引物分别扩增出UL23、US10的左右同源臂,利用PUC19-EGFP构建出重组质粒PUC19-UL23-EGFP和PUC19-US10-EGFP,采用PCR方法将其线性化为目的基因片段UL23(AB)-EGFP和US10(AB)-EGFP。进而设计合成UL23、US10的gRNA(单向RNA),利用PX-330质粒分别构建出PX-330 Cas/gRNA(PX330-UL23-Cas9/gRNA质粒、PX330-US10-Cas9/gRNA质粒)。随后分别将对应的将线性化的目的基因片段、以及PX-330 Cas/gRNA质粒共转染到鸡胚成纤维细胞。根据绿色荧光蛋白表达情况、细胞病变情况结合蚀斑纯化技术以及PCR方法最终拯救出缺失UL23、US10基因的重组鸭瘟病毒△UL23和△US10。实验结果为鸭瘟新型疫苗的研发奠定了良好的物质基础。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

我国于 1957 年由黄引贤报道此病在广部分地区发现本病的流行，给养鸭业造成了巨大的损于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科。病毒粒子呈近球膜较大病毒，核酸为线性、双股 DNA，其主要由四外模、囊膜（如图 1）[3]。DPV 对外界环境的抵抗死亡，高温天气阳光直射的条件下，9h 其毒力降低、强碱敏感，胰蛋白酶、脂肪酶处理可使病毒失一致，囊膜表面没有红细胞凝集素，不具有血凝性鸭体的各个器官、血液、分泌物及排泄物中，其中高。DPV 能在 9-11 日龄的鸭胚中繁殖和传代，4-6d且死亡鸭胚呈现充血、出血、尿囊膜和肝脏上出现胚中连续传代后病毒也能感染鸡胚，可以在鸡胚成病毒感染细胞后在 26-30h 细胞出现病变，形成核内度最高[4]。

CRISPR-Cas9 技术CRISPR-Cas9(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRiated protein 9)技术中 CRISPR 序列的发现是最早是在大肠杆菌中由一位日家发现的，发现之后由于其功能无法定论所以该发现一直没有得到科研工心。到了 1995 年时，西班牙科学家在对地中海极嗜盐菌(Haloferar me)和对沃尔卡尼极嗜盐菌(Haloferar volcanii)的研究中第 2 次发现了类似的结人们又在其他一些细菌的研究中发现这种相似的遗传结构，从此对 CRIS报道开始增多了起来。通过分子生物技术的突飞猛进，人们发现了这段序细菌和古细菌的基因组当中都存在着，这就引起了大众的兴趣。为了准确系列串联重复序列的结构特点，深入研究其功能，R.Jansen 等.将其正式命PR 并一直沿用至今[18]。

图 3 CRISPR-Cas9 介导的基因编辑模式[19]Fig 3 Schematic of genome editing by CRISPR-Cas9[19]ISPR-Cas9 靶位点的选择及相关工具点的选择是基因编辑技术的首要问题。在 CRISPR-Cas9 系统中，端存在 PAM 位点，它才能够被 crRNA 准确识别。每 8 个碱基就PAM 位点，这在一定程度上对靶位点的选择有所限制，但同时也识别效率[20]。张锋实验室建立的网站可以提供碱基序列中的靶位目的和意义来随着我国养鸭业的大力发展，部分地区鸭瘟的流行造成了很大仍是危害养鸭业的主要病毒之一。目前鸭瘟的接种疫苗主要是灭毒疫苗，灭活疫苗产量少且成本较高、免疫期短。虽然鸡胚化弱活疫苗的缺点，但是可能出现毒力返强。此外，鸡胚化弱毒疫苗率逐渐增高的隐患。因此，研制更加有效、安全、多价的鸭瘟疫

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

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相关博士学位论文 前1条

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相关硕士学位论文 前1条

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本文编号：2802525