藏猪IFN-λ3基因克

发布时间：2020-08-25 07:38

【摘要】：当病原体入侵时,机体能够快速产生强大的先天免疫应答,其中干扰素信号通路最为经典。目前,根据干扰素的来源、核苷酸和氨基酸序列、结构、受体以及生物学功能的不同,将其分为Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)、Ⅱ型干扰素(IFN-γ)以及Ⅲ型干扰素(IFN-λ)。Ⅲ型干扰素是近年来新发现的一类干扰素。进一步研究表明其生物学功能和信号通路与Ⅰ型干扰素较为相似,首先与IFN-lR1和IL-10R2组成的受体复合物结合后,激活Jak-STAT信号通路,诱导大量干扰素刺激基因表达。由于Ⅲ型干扰素特异性受体IFN-lR1在上皮细胞和组织的大量表达,研究表明Ⅲ型干扰素在粘膜表面发挥着比Ⅰ型干扰素更特异的抗病毒功能。猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PoRV)感染是一类致死率极高的烈性传染病,具体症状表现为仔猪腹泻,在世界范围内广泛流行,给养猪业造成了巨大的经济损失。肠道上皮细胞是其感染的主要靶细胞。本文首次对藏猪的IFN-λ3基因进行克隆、原核表达、并研究其对猪轮状病毒的抗病毒活性。1.藏猪IFN-λ3基因克隆及生物信息学分析根据GenBank中猪IFN-λ3基因序列(登录号:NM_001166490)设计引物,采用RT-PCR方法从藏猪肠道和肺脏中扩增出其IFN-λ3基因(ZPoIFN-λ3),将藏猪IFN-λ3基因克隆至pMD19-T载体上,构建重组质粒pMD19-T-ZPoIFN-λ3。使用生物信息学软件分析,藏猪IFN-λ3核酸序列与野猪核酸同源性为100%,完整ORF全长588bp。藏猪的IFN-λ3基因编码蛋白共有23个氨基酸信号肽和172个氨基酸的成熟肽。藏猪IFN-λ3编码的氨基酸序列含有13个磷酸化位点、5个糖基化位点,其中1个为N-糖基化位点,4个O-糖基化位点。藏猪IFN-λ3的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。2.藏猪IFN-λ3成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测以pMD19-T-ZPoIFN-λ3质粒为模板,克隆藏猪IFN-λ3成熟肽基因(pMD19-T-mZPoIFN-λ3),构建原核表达载体pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3,于大肠杆菌BL21(DE3)中表达,成功表达大小约为34KDa的目的蛋白,并对诱导时间、IPTG浓度进行了优化。通过超声波破碎获得的包涵体经过镍柱亲和层析后,SDS-PAGE显示蛋白为单一条带。纯化蛋白经过透析复性浓缩,以此为免疫原制备鼠抗ZPoIFN-λ3多克隆抗体,经Western Blotting鉴定,证明获得的目的蛋白具有良好的免疫原性。采用细胞病变抑制法测定蛋白在MDBK/VSV的活性,结果显示pET-32a(+)-mZPoIFN-λ3表达蛋白在MDBK/VSV系统的抗病毒效价为10×2~(4.5)IU/0.1mL,比活力为2×10~3IU/mg。3.藏猪IFN-λ3抗猪轮状病毒活性研究将ZPoIFN-λ3原核表达产物以0、10、100、1000ng/mL的剂量预处理IPEC-J2细胞和MA104细胞24h后,接种0.1MOI PoRV SC-R株,于接种后36h收集细胞悬液。或以100ng/mL的剂量预处理MA104细胞24h后,于接种0.1MOI PoRV SC-R株后12h、24h和36h收集细胞悬液。Q-PCR检测样品中PoRV VP6基因的mRNA水平,结果显示不同剂量的原核表达产物在病毒接种IPEC-J2细胞和MA104细胞后均能有效地抑制PoRV SC-R株的增殖,并呈现一定的剂量和时间依赖,且低浓度的ZPoIFN-λ3(100ng/mL和10ng/mL)在IPEC-J2细胞的抗PoRV活性显著强于在MA104细胞的活性,高浓度(1000ng/mL)则差异不显著。为了探究ZPoIFN-λ3与猪IFN-α联合应用能否增强其抗病毒活性,以0、0.1、1、10ng/mL ZPoIFN-λ3或者0、10、100、1000IU/mL猪IFN-α单独或者联合IFN-α+ZPoIFN-λ3(10IU/mL+0.1ng/mL,100IU/mL+1ng/mL,1000IU/mL+10ng/mL)预处理IPEC-J2细胞24h,接种0.01MOI PoRV SC-R株,于接种后36h收集细胞悬液,反复冻融三次后,以TCID_(50)测定病毒滴度。结果显示所有剂量二者联合应用均没有ZPoIFN-λ3单独应用抑制PoRV SC-R株增殖的活性强。为探究其中机制,相对荧光定量测定下游抗病毒蛋白MxA,OASL和ISG15转录情况,发现单独使用ZPoIFN-λ3诱导的下游抗病毒蛋白转录均高于二者联合应用。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

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图 1-1 Ⅲ型干扰素与 I 型干扰素的表达和信号通路Figure1-1. General induction and receptor signaling pathways of type I and type III IFNs[23] Ⅲ型干扰素的生物学功能1 抗病毒功能在最初发现Ⅲ型干扰素时，研究人员就发现，在不同细胞分别感染登革热病毒、泡口炎性病毒或脑心肌炎病毒可以诱导IFN-λ产生[5]。随后大量报道称在多种DNAA 病毒刺激下细胞能够产生 IFN-λ，如仙台病毒[24]、登革热病毒[25]、轮状病毒[26]吸道合胞病毒[27]等。IFN-λ可以诱导多种抗病毒蛋白的表达。由于Ⅲ型干扰素受体上皮组织和细胞的大量表达，研究表明Ⅲ型干扰素在粘膜表面发挥着Ⅰ型干扰素不替代的作用[28-30]。1.1 IFN-λ在呼吸道免疫中的研究呼吸道病毒常感染鼻窦、咽喉和肺脏。感染后主要产生 IFN-λs，而不是 IFN-α。

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图 2-1.藏猪 IFN-λ3 的 PCR 扩增PCR amplification of Tibetan IFN-λ3 gA Marker，1：PCR 产物，2：阴性对NA Marker, 1:PCR product, 2:Negativ-λ3 PCR 鉴定 PCR 扩增，扩增出与预期目标-2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 的 PCR 鉴定ation of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3 gen

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16图 2-2 pMD19-T-ZPoIFN-λ3 的 PCR 鉴定ntification of the pMD19-T-ZPoIFN-λ3 gene usDNA Mrker，1-5：PCR 产物，6：阴性对照M:DNA Marker, 1-5:PCR product, 6:negative序结果BI 网站进行 Blast 比对，其与 GenBank，表明克隆成功，核酸序列如下：TCGCTGGTGCTGGTGCTGGTGCTGAGGTGCCTGTCCCTGAAGCCCTCAGGTGGCCCAGTTCAAGTCTCTGTCCCCAAGGATGCCTTTGAAGAGTCCCTCT

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