2017-2018年华东地区禽源沙门菌的流行病学调查及基于鸡白痢沙门菌LPS间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-08-25 13:16

【摘要】：沙门菌是一种人兽共患性的病原菌,既可引起人的食源性疾病,又对养禽业造成严重的威胁,其中禽源沙门菌占有重要的地位。宿主专嗜性的鸡白痢沙门菌可感染不同日龄的鸡引起急性或慢性传染病,不仅能水平传播,还能垂直传播,对养禽业危害巨大。鸡白痢传统的检测方法主要是玻板凝集试验检测抗体和PCR方法检测病原。玻板凝集试验虽然简便快速,但是受主观判断影响较大;而多重PCR检测技术,虽然特异性好,但仪器和试剂的成本较高。因此,急需建立一种简便快速、灵敏性高、特异性强而成本又低的鸡白痢检测方法。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的O抗原多糖链高度可变,特异性地决定了细菌的血清型,具有良好的免疫原性和抗原性。以此建立检测方法可特异性地检测鸡白痢沙门菌的感染抗体,对鸡白痢的检疫和净化尤为重要。本研究采集了 2017-2018年华东地区疑似沙门菌感染的病料,首先进行沙门菌的分离培养,通过mPCR和血清学方法进行血清型鉴定,并测定其对22种常用抗生素的敏感性,其次提取并纯化鸡白痢沙门菌分离株S6702和S44的LPS,建立检测鸡白痢沙门菌抗体的间接ELISA方法。1.2017-2018年华东地区禽源沙门菌的分离鉴定及耐药性分析2017-2018年期间,从华东地区疑似家禽沙门菌感染病例采样分离,利用mPCR和血清学方法,共鉴定出71株沙门菌,其中鼠伤寒沙门菌33株,鸡白痢沙门菌25株,肠炎沙门菌10株,纽波特沙门菌2株和德尔卑沙门菌1株。通过药敏试验对71株沙门菌分离株进行耐药性测定,结果显示,所分离的沙门菌对β-内酰胺类、大环内酯类的抗生素的耐药率较高。71株细菌的多重耐药率是92.96%。由此可见,2017-2018年分离到的沙门菌多重耐药性十分严重。2.鸡白痢沙门菌的脂多糖的提取与鉴定通过改进的热酚水法提取鸡白痢沙门菌的LPS,两株鸡白痢沙门菌(S6702和S44)的LPS产率分别是4.3%和3.6%;LPS纯化后其中的核酸含量分别为0.011%和0.011%;蛋白含量分别为0.39%和0.49%;多糖含量分别为18.3%和16.5%。将提取的鸡白痢沙门菌LPS进行SDS-PAGE电泳及银染,结果显示鸡白痢沙门菌S44和S6702的LPS表型均呈现梯状结构,为光滑型LPS。因此,可用于检测方法的建立。3.鸡白痢抗体间接ELISA方法的建立使用上述方法提取的LPS建立间接ELISA鸡白痢抗体检测方法。对间接ELISA的最佳反应条件进行摸索,确定其抗原包被浓度为1.25μg/mL,待检血清最适稀释度为1:800,最适封闭液为5%山羊血清,酶标抗体的最适工作浓度为1:16000,血清反应的最佳时间为60 min,显色液反应时间为15 min。由S6702的LPS建立的间接ELISA阴阳性OD450nm临界值为0.269。用该间接ELISA检测方法对变形杆菌、普罗威登斯菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌和鼠伤寒等常见病原感染鸡的阳性血清进行检测,结果均呈现阴性,表明该方法具有良好的特异性;检测阳性血清时玻板凝集试验效价为1:64,该ELISA检测效价为1:12800,具有更高的敏感性。广谱性和重复性试验结果表明,该方法可检测不同鸡白痢沙门菌高免血清,批间和批内重复性好。对100份临床血清进行检测,该ELISA方法与玻板凝集试验的符合率是89%,与进口 ELISA检测试剂盒的符合率是93%。综上,2017-2018年华东地区沙门菌的多种耐药现象严重;基于LPS的间接ELISA鸡白痢检测方法特异性好,敏感性高。因此,该检测方法适用于临床鸡群鸡白痢抗体水平检测,可为鸡白痢净化工作提供技术支持。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

沙门菌

单个菌落接种于５ｍＬＬＢ液体培养基中，３７°Ｃ培养１６？１８ｈ后，用１５％甘油液，使其0Ｄ６ｅＱｎｎｉ值为０．１。将稀释后的菌液用灭菌棉签均匀涂布于ＬＢ琼脂块板子上贴６个药敏纸片，３７°Ｃ培养１６？１８邋ｈ后量取抑菌圈直径，重复３次，分析其耐药率及多重耐药性逡逑３结果逡逑３．１沙门菌的分离培养结果逡逑沙门菌在麦康凯培养基上生长为无色至浅橙色、透明或半透明，菌落中心在沙门菌属显色培养基上呈紫红色或紫罗兰色、扁平透明的菌落。革兰氏染端钝圆的短杆菌，无荚膜和芽孢。逡逑３．２沙门菌的多重ＰＣＲ的鉴定逡逑经ｍＰＣＲ鉴定，从２０１７年－２０１８年共分离鉴定７１株沙门菌，其中鼠伤寒鸡白痢沙门菌２５株，肠炎沙门菌１０株，３株其它沙门菌。所有沙门菌属均可的属特异性条带。其中，鼠伤寒沙门菌可另外扩增出４０１邋ｂｐ的型特异性条带，菌可另外扩增出大小为２５２邋ｂｐ的型特异性条带，肠炎沙门菌可另外扩增出大的型特异性条带，具体见图１小逡逑

震摇,银染,去离子水,沙门菌

０１８年华东地区禽沙门菌的流调及鸡白痢沙门菌ＬＰＳ间接ＥＬＩＳＡ２００邋ｍＬ邋３０％去离子水，摇床上室温震摇１０邋ｍｉｎ；弃掉去震摇２邋ｍｉｎ进行增敏，弃去银染增敏液，去离子水洗涤水，加入１００邋ｍＬ银溶液，室温震摇１０邋ｍｉｎ银染；弃去银溶震摇１－１．５邋ｍｉｎ；弃掉去离子水，加入１００邋ｍＬ银染显色液，ＬＰＳ条带。逡逑定，Ｓ６７０２鸡白痢沙门菌样品和Ｓ４４鸡白痢沙门菌样品沙门菌特异性条带，表明二者确为鸡白痢沙门菌。结果

标准曲线,标准曲线,多糖含量

逑３＿２．２邋ＬＰＳ蛋白含置测定逡逑经分光光度计得到ＢＣＡ标准曲线（图２－１），从标准曲线得出其蛋白含量与吸光度关逡逑系式为：ｙ＝０．８９１２ｘ－０．１２４９，将ＬＰＳ进行梯度稀释，使所测ＯＤ５９５ｎｍ在标准曲线范围内，将逡逑平均值带入方程，得出Ｓ６７０２蛋白浓度为０．０４９ｍｇ／ｍＬ，纯化后的ＬＰＳ中的Ｓ６７０２蛋白含逡逑量为０．３９％。Ｓ４４蛋白浓度为０．０５６邋ｍｇ／ｍＬ，纯化后的ＬＰＳ中的Ｓ４４蛋白含量为０．４９％。逡逑标准蛋白浓度曲线逡逑０．４５－逡逑°４－逡逑０．３Ｓ－逦？？？？？逡逑０逦３－逦．．．？＊＊＊＊邋ｙ邋－邋０．３＊１６３ｘ邋＋邋０．０５０８逡逑Ｉ邋０．２５－逦？？？？，？？？逦Ｒ２邋＝邋０．９９８１逡逑０．１－邋？？？？？逡逑０．０５－逡逑０逦０．２逦０．４逦０．６逦０．８逦１逦１．２逡逑蛋白浓度（ｍｇ／ｍＬ）逡逑图２－１邋ＢＳＡ标准曲线逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ＢＳＡ逡逑３．２．３邋ＬＰＳ多糖含量测定逡逑采用苯酚－硫酸法测定ＬＰＳ多糖含量，经分光光度计得到葡萄糖标准曲线（图２－２），逡逑从标准曲线得出其多糖含量与吸光度关系式为：ｙ＝０．５８８４＞ｃ＋０．０９８１，将ＬＰＳ进行梯度稀释，逡逑使所测0Ｄ５９５ｎｍ在标准曲线范围内，将平均值带入方程，得出Ｓ６７０２多糖浓度为２．２５邋ｍｇ／ｍＬ，逡逑纯化后的ＬＰＳ中的Ｓ６７０２多糖含量为１８．３％？邋Ｓ４４多糖浓度为１．８６邋ｍｇ／ｍＬ

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