PRRSV-1 VLPs的构建及免疫原性研究
发布时间：2020-08-25 16:14
【摘要】：本研究结合当前猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)致病机制、疾病防控及病毒基因功能研究进展,以欧洲型PRRSV(RRSV-1)的ORF5编码蛋白为主要免疫原,利用Bac-to-Bac~?杆状病毒-昆虫细胞表达系统,采用4种不同的蛋白表达策略,包装制备由GP5和M蛋白组成的欧洲型PRRSV病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),并通过鼻腔黏膜免疫途径分析其免疫原性。首先以本实验室保存的欧洲型PRRSV LV株基因组为模板,通过RT-PCR方法获得PRRSV-1 GP5和M基因,利用生物信息学及相应软件分别对两种基因的遗传进化关系及其编码蛋白结构进行分析;同时从猪肺巨噬细胞中扩增获得猪IFN-λ1基因,并将其与PRRSV M基因融合,信号肽和跨膜区分析显示,IFN-λ1的融合可能不影响M蛋白表达。进而将GP5、M或pIFN-λ1基因分别克隆到杆状病毒穿梭载体pFast Bac HTA/C或pFastBac Dual中,采用热激法将重组穿梭质粒转化至DH10~?Bac大肠杆菌感受态细胞;使用蓝白斑筛选技术获得重组杆粒rB-GP5、rB-M、rB-pIFNλ1、rB-M-pIFNλ1或rBD-GP5-M;采用阳离子转染方法将重组杆粒转染至SF9细胞,拯救重组杆状病毒。重组杆状病毒扩大培养至第二代,采用酶联免疫斑点实验法测定重组杆状病毒滴度,同时利用Western Blot、间接免疫荧光等方法检测GP5和M蛋白的表达情况;然后设置病毒感染不同时间点检测GP5和M蛋白的表达情况,以确定病毒样颗粒的最佳收获时间;使用无血清表达系统大量制备PRRSV VLPs,收集细胞培养上清,采用蔗糖垫超速离心、蔗糖密度梯度离心策略进行纯化,Western blot鉴定GP5和M均存在后,利用透射电镜观察所收集的VLPs的形态;最后以小鼠为试验动物,通过鼻腔免疫策略及免疫后体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫指标的检测,分析VLPs的免疫原性,同时添加A5佐剂,并对VLPs-A5复合物的免疫原性进行了评价。结果显示,GP5和M蛋白共表达策略,即利用pFastBac Dual载体,构建重组杆粒rBD-GP5-M,包装并拯救同时携带PRRSV-1 GP5和M蛋白基因的重组杆状病毒rBDV-GP5-M,感染无血清悬浮培养的SF9细胞可以成功包装出具有PRRSV相似形态结构的VLPs。将纯化的VLPs作为免疫原,通过鼻腔免疫途径免疫小鼠,整个试验过程中小鼠的体重呈现稳定上升趋势,免疫过程没有引起小鼠过于强烈的应激反应;单独使用VLPs和VLPs+A5均能通过鼻腔免疫途径诱导小鼠局部sIgA分泌量增加,及全身性具有中和作用的IgG抗体水平升高;免疫应答类型是以B细胞免疫应答为主的体液免疫;A5递送系统能够让VLPs缓慢释放,使得机体的抗体水平保持在持续上升的状态,提供长期的免疫保护,表明PRRSV-1 VLPs具有开发成安全有效的新型黏膜疫苗的潜能,A5递送系统可增强粘膜免疫应答水平。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
且自身具有良好的佐剂功能，从而能更加有效的激活固有免疫和具有良好的应用前景。 VLPs 的结构多样性s 的不同导致其结构和功能上存在差异，一般分为无囊膜和有囊膜两类步细分为单衣壳蛋白 VLPs 和多衣壳蛋白 VLPs。无囊膜 VLPs 一般仅，而有囊膜VLPs一般同时包含病毒的囊膜蛋白和表达宿主细胞的细胞 VLPs 是由单个衣壳蛋白组成，如批准上市的 HPV VLPs，这类 VLP系统或真核表达系统进行表达，还可以采用无细胞表达系统进行包P 使用大肠杆菌表达系统、杆状病毒昆虫细胞表达系统及酵母表达系统5, 6]。而由多个衣壳蛋白组成的无囊膜 VLPs 一般来说相对复杂，这类要较高级的真核宿主细胞，如酵母、昆虫细胞或植物细胞等，可以在同达多种用于组装 VLPs 的衣壳蛋白[3]。有囊膜的病毒在组装和出芽的过主细胞内获得脂质体囊膜，一种或多种具有中和表位的糖蛋白锚定在囊上，这类 VLPs 相对于无囊膜的 VLPs 来说，其结构分布不均匀导致其
VLPs 由于其结构具有多样性导致其功能也存在多样性，目前最广为人知的就是可为免疫原进行应用，如目前世面上所应用的各种 VLPs 疫苗均基于此功能设计[9]。对囊膜 VLPs 还可以携带与其不相关的其他病毒的结构蛋白或同种病毒不同亚型的结构，例如 McGinnes 等人成功的在 NDV VLPs 上插入了 RSV 的 F 蛋白和 G 蛋白[10]；Pus人在 IAV VLPs 表面插入了 3 个不同亚型的 HA 蛋白[11]。这些混合 VLPs 体现出了一种的疫苗设计策略。由于 VLP 的特殊结构允许插入多种重复的抗原蛋白并展示在颗粒表面，因此将不抗原串联或通过化学耦联在一起展示在 VLPs 表面的策略已经被应用于新型 VLPs 疫计当中[12-14]，同时分子量较大的抗原也会增加抗体反应，从而打破了抗原表位的限制以 HBV 核心抗原为骨架设计的多种疫苗均基于此特点设计[15]。此外一些有囊膜或无囊膜但包含病毒的核衣壳蛋白 VLPs 能够同时包裹蛋白质、小微粒、核酸等物质，人们利用这一特性将此类 VLPs 设计成为抗原物质或药物的递送，使得抗原或药物能够被靶向递送到发挥作用的细胞、组织或器官部位。如 Kawanoeswani 等人利用 SV40 VLPs 或逆转录病毒 VLPs 包裹运输核酸[16, 17]。
展示在昆虫细胞表面。杆状病毒-昆虫细胞表达系统还常被用来表膜或无囊膜，分泌型或胞内型（图 1.1.6-A）。将外源蛋白与杆状合表达，还可以将外源蛋白靶向到昆虫细胞表面，进一步随杆状状病毒表面（图 1.1.6-B）。杆状病毒还可以用来作为类似于 AAV基因，使用两种杆状病毒分别表达 AAV 的 rep 蛋白和 cap 蛋白，毒来携带和扩增所目的 DNA（GOI,Gene of interest），共感染细胞重组 re-AAV（图 1.1.6-C）[32]。杆状病毒-昆虫细胞表达系统还可统，将外源基因插入到哺乳动物细胞启动子下游，利用昆虫细胞染哺乳动物细胞，从而将外源基因带入哺乳动物细胞进行表达（病毒只能在昆虫细胞内增殖，因此有望利用这一特性将其设计疫苗，以改善目前病毒载体疫苗使用过程中的安全性问题。
本文编号：2803913
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
且自身具有良好的佐剂功能，从而能更加有效的激活固有免疫和具有良好的应用前景。 VLPs 的结构多样性s 的不同导致其结构和功能上存在差异，一般分为无囊膜和有囊膜两类步细分为单衣壳蛋白 VLPs 和多衣壳蛋白 VLPs。无囊膜 VLPs 一般仅，而有囊膜VLPs一般同时包含病毒的囊膜蛋白和表达宿主细胞的细胞 VLPs 是由单个衣壳蛋白组成，如批准上市的 HPV VLPs，这类 VLP系统或真核表达系统进行表达，还可以采用无细胞表达系统进行包P 使用大肠杆菌表达系统、杆状病毒昆虫细胞表达系统及酵母表达系统5, 6]。而由多个衣壳蛋白组成的无囊膜 VLPs 一般来说相对复杂，这类要较高级的真核宿主细胞，如酵母、昆虫细胞或植物细胞等，可以在同达多种用于组装 VLPs 的衣壳蛋白[3]。有囊膜的病毒在组装和出芽的过主细胞内获得脂质体囊膜，一种或多种具有中和表位的糖蛋白锚定在囊上，这类 VLPs 相对于无囊膜的 VLPs 来说，其结构分布不均匀导致其
VLPs 由于其结构具有多样性导致其功能也存在多样性，目前最广为人知的就是可为免疫原进行应用，如目前世面上所应用的各种 VLPs 疫苗均基于此功能设计[9]。对囊膜 VLPs 还可以携带与其不相关的其他病毒的结构蛋白或同种病毒不同亚型的结构，例如 McGinnes 等人成功的在 NDV VLPs 上插入了 RSV 的 F 蛋白和 G 蛋白[10]；Pus人在 IAV VLPs 表面插入了 3 个不同亚型的 HA 蛋白[11]。这些混合 VLPs 体现出了一种的疫苗设计策略。由于 VLP 的特殊结构允许插入多种重复的抗原蛋白并展示在颗粒表面，因此将不抗原串联或通过化学耦联在一起展示在 VLPs 表面的策略已经被应用于新型 VLPs 疫计当中[12-14]，同时分子量较大的抗原也会增加抗体反应，从而打破了抗原表位的限制以 HBV 核心抗原为骨架设计的多种疫苗均基于此特点设计[15]。此外一些有囊膜或无囊膜但包含病毒的核衣壳蛋白 VLPs 能够同时包裹蛋白质、小微粒、核酸等物质，人们利用这一特性将此类 VLPs 设计成为抗原物质或药物的递送，使得抗原或药物能够被靶向递送到发挥作用的细胞、组织或器官部位。如 Kawanoeswani 等人利用 SV40 VLPs 或逆转录病毒 VLPs 包裹运输核酸[16, 17]。
展示在昆虫细胞表面。杆状病毒-昆虫细胞表达系统还常被用来表膜或无囊膜，分泌型或胞内型（图 1.1.6-A）。将外源蛋白与杆状合表达，还可以将外源蛋白靶向到昆虫细胞表面，进一步随杆状状病毒表面（图 1.1.6-B）。杆状病毒还可以用来作为类似于 AAV基因，使用两种杆状病毒分别表达 AAV 的 rep 蛋白和 cap 蛋白，毒来携带和扩增所目的 DNA（GOI,Gene of interest），共感染细胞重组 re-AAV（图 1.1.6-C）[32]。杆状病毒-昆虫细胞表达系统还可统，将外源基因插入到哺乳动物细胞启动子下游，利用昆虫细胞染哺乳动物细胞，从而将外源基因带入哺乳动物细胞进行表达（病毒只能在昆虫细胞内增殖，因此有望利用这一特性将其设计疫苗，以改善目前病毒载体疫苗使用过程中的安全性问题。
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 李冰;刘丽颖;王辉暖;周铁忠;;欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染仔猪病理学特征及其组织内病毒分布[J];动物医学进展;2015年07期
2 曹永芝;马卫明;陈书民;柴同杰;宋移福;贺加双;刘莲莲;谢冰;;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)气溶胶的发生与传播机制[J];中国兽医学报;2010年02期
3 孙颖杰,孙延峰,潘凤城,苏永生,刘宏智,徐景清,曹运良,张杰,卢桂琴;猪生殖和呼吸综合征的检疫和诊断[J];中国兽医杂志;1997年02期
本文编号：2803913
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