猪瘟病毒E0蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达、鉴定及条件优化

发布时间：2020-08-25 19:03

【摘要】：猪瘟(Classical swine fever,CSF),又名猪霍乱(Hog cholera),是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus,CSFV)引起的急性、热性、高度接触性传染病,具有高发病率、高致死性等特点,给全球养猪业造成了巨大的经济损失,严重影响了养猪业的健康发展。CSFV中的保护性抗原蛋白E0(E~(rns)),是该病毒内唯一可分泌到感染细胞上清中的囊膜糖蛋白,也是病毒吸附进入敏感细胞的必须蛋白,因此体外生产CSFV E0蛋白对诊断及防制CSF具有重要意义。本实验根据毕赤酵母的密码子偏爱性,将CSFV E0蛋白成熟肽片段进行优化合成,利用PCR方法从重组质粒yE0-sys中扩增得到优化后的CSFV E0成熟肽基因,将该片段与毕赤酵母载体pPICZαA分别双酶切后进行连接,构建得到重组表达质粒pPICZαA-E0,用限制性内切酶SacⅠ将其线性化后,电转入毕赤酵母X-33感受态细胞。经博来霉素(Zeocin)高抗筛选后,将经鉴定的阳性重组酵母菌进行甲醇诱导分泌型表达,通过将表达产物上清经SDS-PAGE、Western-blot和凝胶质谱测序分析,证实CSFV E0蛋白在毕赤酵母中成功实现分泌型表达;通过对最佳诱导时间、溶氧量、最佳甲醇诱导浓度等条件进行摸索优化,得到了CSFV E0蛋白在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,即在28℃的诱导温度下,培养摇瓶体积1/10的菌液,并在表达培养基中添加1%Tween-80,同时始终保持1%的甲醇诱导终浓度,诱导表达72h时表达量可达到峰值。按此表达条件,在比较重组酵母菌不同转化子表达量的差异后,选用筛选得到的优势菌株进行表达,诱导分泌72h时,表达量达到25.6mg/L。经过重复性实验验证,本研究构建的重组酵母菌pPICZαA-E0-X33能够在毕赤酵母中实现稳定的分泌表达,且将表达菌液上清进行超滤浓缩后,使用镍离子金属亲和层析柱进行纯化,得到了大小约37kDa具有N-连接的糖基化CSFV E0蛋白,为监测、诊断和防制CSF及研发有关CSFV E0蛋白的生物制品提供了物质条件。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651

【参考文献】

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本文编号：2804081