小鼠附植前胚胎新生DNA甲基化的特点及功能分析

发布时间：2020-08-25 19:36

【摘要】：早期胚胎会经历剧烈的表观修饰变化,其中最为显著的是囊胚之前胚胎整体持续的DNA去甲基化(DNA demetylation)过程,以及囊胚之后新生DNA甲基化(de novo DNA methylation),这两个过程对于胚胎的质量和发育能力,至关重要。一般认为,de novo DNA methylation主要发生在囊胚之后的附植过程中。我们发现,负责de novo DNA methylation最为关键的DNA甲基转移酶--DNMT3B,在附植前的发育阶段,即8-cell之后,在mRNA和蛋白水平都有明显的表达。因此我们推测,胚胎在附植之前有可能已经部分地发生了de novo DNA methylation。为了验证这一假设,我们利用已发表的附植前胚胎DNA甲基化数据,对8-cell到囊胚内细胞团(inner cell mass,ICM),即Dnmt3b已经表达的这一阶段的DNA甲基化动态进行了“再分析”。数据显示,附植前的确存在de novo DNA methylation的现象,在这一阶段,一共有3401个基因的promoter出现了DNA甲基化上调,占到基因综述的28.54%。而DNA demethylation仍然是这一阶段的主要趋势,有8257个基因的promoter出现了DNA甲基化降低的趋势,占到基因总数的71.46%。此外,分析还发现,附植前de novo DNA methylation主要发生在CpG密度较高(HCG)的区域,并且与常染色体相比,X染色体发生de novo DNA methylation的比例更高。进一步,为了了解这些甲基化变化可能的生物学意义,我们利用附植前胚胎转录组数据,我们对8cell到ICM的甲基化变化和基因表达变化,进行了整合分析。结果显示,附植前de novo DNA methylated promoter主要是倾向于对细胞增殖、细胞器功能和基因表达进行调控,而DNA demethylated promoter则主要倾向于对细胞分化的命运、细胞代谢能力进行调节。在上述基础上我们进一步分析了IVF囊胚和体内囊胚DNA甲基化修饰的差异,发现IVF囊胚整体的DNA甲基化水平明显偏高。在应当发生de novo DNA methylation的promoter中,只有小部分出现上升不足的问题,而大量应该发生DNA demethylation的基因则没有充分地下调甲基化修饰。同时,我们还发现附植前体内外胚胎Dnmts的表达并无显著差异,因此推测IVF囊胚整体甲基化偏高的问题可能是由于DNA demethylation不充分导致的。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S814
【图文】：

胚胎新生甲基化的动态特征前胚胎在囊胚之前会经历持续的 DNA 去甲基化（D新生 DNA 甲基化（de novo DNA methylation）。然 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，Dnmntation 前阶段，胚胎可能已经部分启动了 de nov假设，我们对已经发表的小鼠早期胚胎 DNA 甲基ation bisulfite sequencing）数据，以及 RNA-seq 转录89]。显示，附植前胚胎中主要负责新生甲基化的 Dnmt3因组激活之后启动了转录（图 2.1 A）。这与我们在合的（2.2 A）。进一步我们通过 Western Blottig 和的 DNMT3B 表达(2.2 B，C)，因此我们推测在 移酶已经启动了新生 DNA 甲基化过程。

图 2.2 DNMTs 在早期胚胎 mRNA 及蛋白表达Fig.2.2 The mRNA and protein levels of DNMTs in pre-implantation embryos（A）RT-qPCR 检测体内不同时期 DNA 甲基化相关转移酶的 mRNA 水平（B）表示 Western Blotting 分别检测桑椹胚胎和囊胚阶段 DNMT3B 的蛋白水平（C）表示免疫荧光检测囊胚阶段 DNMT3B 的表达情况。以上结果至少进行三次生物学重复。2.2 新生 DNA 甲基化过程中甲基化的变化情况为了进一步确认附植前胚胎发育阶段是否发生了 de novo DNA methylation，我们对2012 年发表在 Nature 上的高通量的 DNA 甲基化（RRBS）数据进行再分析。发现附植前胚胎整体呈现 DNA 去甲基化的趋势，且在 ICM 阶段，DNA 甲基化达到最低（图 2.3A）基于之前 Dnmt3b 和 Dnmt3l 的表达特征，我们重点对 8-cell 到内细胞团（inner cell mass，ICM）阶段甲基化变化进行更加细致的分析。与文献报道及我们推测一致的是，虽然从8-cell 到 ICM 阶段，总体是 DNA 甲基化下降的，但仍然有 3401 个基因 promoter 区的 DN甲基化修饰发生了上调，约占 28.54%（图 2.3 B，C），我们将其定义为附植前的 de novDNA methylation。进一步对不同变化倍数（fold change，FC）promoter 区的数量进行分析可以看到，在甲基化升高的 promoter 中，大部分的 DNA 甲基化上升幅度不大（FC<2）

图 2.3 8cell 到 ICM 阶段，DNA 甲基化的变化情况。Fig.2.3 The change of methylation during 8cell to ICM.（A）胚胎在不同时期的甲基化水平（B）8cell 到 ICM 阶段 DNA 甲基化的变化（C）8cell 到 ICM 阶段，发生 de novo DNAmethylation 与 DNAdemethylation 的数量（D、E）分别表示不同 fold change 下，promoters 所占数目(D)及比例（E）2.3 DNA 甲基化过程中 CpG 分布情况具有 CpG 二核苷酸特征的 DNA 序列是甲基化修饰的主要区域，CpG 密度与 DNA 甲基化修饰状态和动态密切相关。根据基因 Promoter 区 CpG 的密度不同，可以划分为三类：LCP（Low CpG density promoter）；ICP（intermediate CpG density promoter）；HCP（highCpG density promoter）。为了确认，我们进一步对 8-cell 到 ICM 阶段，promoter 区的甲基化变化与 CpG 之间的关系进行分析。数据显示，附植前的胚胎 DNA demethylation 更加偏好于发生在 HCP，并且不同下调幅度的promoter对CpG密度没有选择性偏好（图2.4 A，B）然而在de novo DNA methylation则 表 现 出 对 CpG 密 度 具 有 不 同 的 选 择 。 在 上 调 较 为 剧 烈 或 剧 烈 的 promoter

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本文编号：2804115