鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备及免疫胶体金快速检测技术研究

发布时间：2020-08-26 01:10

【摘要】：鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一种侵害雏鸭、鹅等禽类的急性或慢性传染病,以纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为主要临床特征。目前RA在国内流行血清型主要为1、2、10型,各血清型之间缺少有效交叉免疫保护性,几乎所有血清型只与同源抗血清发生特异性反应且RA各血清型之间的抗原结构存在较大差异。临床上常用实验室方法如ELISA、PCR进行诊断,但这些方法耗时长,需要专业的技术人员。本研究基于抗OmpA/motb蛋白的兔多克隆抗体和RA单克隆抗体,建立一种适用于临床的快速、简便的检测RA血清1、2、10型的方法。1鸭疫里默氏杆菌OmpA/motb的表达及多克隆抗体的制备以RA CH3基因组DNA为模板,PCR扩增ompA/motb基因,构建出表达载体pET30a-OmpA/motb,将质粒pET30a-OmpA/motb转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,经IPTG诱导表达重组蛋白OmpA/motb。Western blot结果显示,rOmpA/motb能与血清1、2、10型RA阳性血清发生特异性反应。以纯化的rOmpA/motb免疫新西兰大白兔,经三次免疫后兔血清中抗OmpA/motb蛋白的抗体效价为1:256,000,Western blot结果显示OmpA/motb兔多抗可与血清1型、2型、10型RA菌株发生特异性结合反应,与其他菌株无反应性。2鸭疫里默氏杆菌单克隆抗体的制备前期研究中,我们筛选到1株具有血清1、2和10型交叉免疫原性的RA脂多糖突变株RA1062。本研究以RA脂多糖突变株RA1062免疫BALB/c小鼠,细胞融合后分别以血清1、2、10型RA菌株(CH3、NJ3、HXb2)作为包被抗原,筛选出能稳定分泌抗血清1、2、10型RA菌株的单克隆抗体杂交瘤细胞株。通过体内诱生腹水法制备抗体,并分析获得的腹水单抗特性。本次共获得3株RA单克隆抗体,分别命名为2C2、2D9和3E3,3株单抗亚类鉴定均为IgM。ELISA结果表明,2C2、2D9和3E3腹水效价依次分别为1:64,000,1:128,000,1:64,000。Western blot结果显示,3株单抗均能与血清1、2和10型RA菌株(CH3、NJ3、Hxb2)发生特异性反应,与其他禽源致病菌不发生反应,表明获得的单克隆抗体具有良好的血清型交叉反应性及种属特异性。3鸭疫里默氏杆菌免疫胶体金快速检测技术研究应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记上述制备的单克隆抗体(2C2、2D9、3E3、抗OmpA/motb兔血清)。通过对胶体金稀释液、NC膜、金标垫等优化,确定了以单抗3E3标记胶体金颗粒,以单抗2C2作为检测线,以羊抗鼠IgG作为质控线,制备了RA快速检测试纸条。该试纸条能够检测出鸭疫里默氏杆菌血清1、2、10型菌株,但对于禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌及巴氏杆菌不发生反应。该试纸条最低能够检测出2.5×10~6CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌。综上所述,基于RA LPS缺失株RA1062制备的单克隆抗体研制的金标试纸条具有良好特异性,可用于RA血清1、2、10型菌株检测。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：

试纸条,结构示意图,封闭液,质控

适金标抗体复合物平铺于经封闭液处理后的金标垫上，37 ℃烘干G 稀释至 1.5 mg/mL 作为控制线(Control line, C 线)，RA 单克隆抗g/mL、1.5 mg/mL 和 2.0 mg/mL 作为检测线(Test line, T 线)。喷线完。取 100 μL 鸭疫里默氏杆菌 WJ4、Yb2、HXb2 菌液(2.5×109CFU液滴加至样品垫上，观察结果，以选择最适的抗体反应浓度。纸条的组装及结果判定最佳封闭液对金标垫进行处理，37 ℃烘干备用。备完成的金标抗体复合物均匀的平铺于处理后的金标垫上，37 ℃体金喷线仪将上述确定的最适浓度的抗体喷线于 NC 膜上，待第一干后在相同的位置重复喷线一次。如图 1 1[76]组装试纸条。的判定：当检测结果为阳性时可见质控线与检测线均出现肉眼可见不出现肉眼可见的条带，质控线出现或不出现条带时，结果均判定示)）。

试纸条,质控,条带,最适浓度

及结果判定对金标垫进行处理，37 ℃烘干备用。标抗体复合物均匀的平铺于处理后的金标垫将上述确定的最适浓度的抗体喷线于 NC 膜的位置重复喷线一次。装试纸条。检测结果为阳性时可见质控线与检测线均出可见的条带，质控线出现或不出现条带时，图 1 1 胶体金免疫试纸条结构示意图Fig.1 1 The sketch map of gold immunochromatographic str

基因扩增,产物,重组载体,质粒

2.1.2 重组载体 pET30a-OmpA/motb 的构建用 BamH I 和 Sal I 双酶切目的基因片段和表达载体后，用 Ligation Mix 进行连接并转化至DH5α中，PCR鉴定获得2株阳性克隆，命名为pET30a-OmpA/motb(图2 2A)。双酶切鉴定结果表明目的片段大小与理论值一致(图 2 2B)。测序结果表明，重组载体中的 ompA/motb 基因序列完全正确，表明成功构建了重组载体 pET30a-OmpA/motb。图 2 2 重组载体 pET30a-OmpA/motb 的构建Fig 2 2 Construct of recombinant pET30a-OmpA/motbA.重组 pET30a-ompA 载体 PCR 鉴定; M: DL 2000 DNAMarker; 1: 阴性对照; 2~3: E.coli BL21 (DE3)菌株(含质粒 pET30a-OmpA/motb)ompA/motb 基因扩增产物; B.重组 pET30a-OmpA/motb 载体双酶切鉴定; M: DL 10000 DNA Marker; 1: pET30a-OmpA/motb 质粒经 BamH I和 Sal I 双酶切产物; 2: pET-30a（+）质粒经 BamH I 和 Sal I 双酶切产物A. Identification of recombinant pET30a-ompA/motb by PCR; M: DL 2000 DNA Marker;2-3: The ompA/motb gene was amplified from E. coliBL21(DE3) which contains recombinant pET30a-OmpA/motb; 1:Negative control; B. Identification of recombinant pET30a-OmpA/motb bydual-enzyme digestion; B. M: DL 10000 DNAMarker; 1:

【参考文献】