鸡MDA5调控新城疫病毒免疫反应机制研究

发布时间：2020-08-26 07:38

【摘要】：新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease virus,NDV)强毒株引起的家禽急性高度接触性传染病,临床症状主要以体温升高、下痢、神经损伤、呼吸障碍、消化道和呼吸道的出血为特征。NDV可以感染包括家禽在内的至少240种鸟类和一些哺乳动物。该病在世界范围内广泛流行,给养禽业带来了巨大的经济损失。我国采取了积极免疫的措施进行ND的防控,已经控制了ND在我国大范围的流行,但由于我国养殖场生物安全体系差、NDV免疫失败等原因,ND的局部暴发时有发生。因此迫切需要探索新的ND防控策略。鸡MDA5(Chicken Melanoma Differentiation Association antigen 5,chMDA5)是鸡体细胞内监测外源病毒感染的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor,PRR)之一,能够识别NDV感染,并介导干扰素(Interferon,IFN)的表达,启动鸡体的抗病毒天然免疫反应。探究chMDA5对NDV感染和宿主免疫反应的调控,有助于从机体角度阐明抗病毒和增强疫苗免疫力的机制,为揭示病毒和机体之间的相互作用提供新的资料,为提高NDV疫苗免疫效果提供新的参考。本课题主要研究内容和结果如下:1.chMDA5在体外诱导干扰素表达的研究NDV强毒株F48E9和弱毒株La Sota以0.1 MOI感染DF-1细胞,在感染后8 h、12 h、24 h和48 h用RT-qPCR方法检测chMDA5和IFN-β表达发现,F48E9和La Sota感染DF-1细胞都能引起chMDA5表达的上调,F48E9感染DF-1细胞诱导IFN-β表达上调,而La Sota感染DF-1细胞只有在感染后24 h时诱导IFN-β表达上调。将F48E9和La Sota以10~5PFU/只感染SPF鸡,用RT-qPCR方法检测chMDA5和IFN-β表达发现,F48E9和La Sota感染鸡体后均能诱导鸡体肺脏chMDA5和FN-β表达上调;F48E9感染鸡体后诱导鸡体脾脏chMDA5表达上调,诱导IFN-β表达先下调后上调再达到正常水平;La Sota感染鸡体后,12 h鸡体脾脏chMDA5表达下调,24 h和48 h后chMDA5表达上调,抑制鸡体脾脏IFN-β表达。应用带有chMDA5的真核表达质粒在DF-1上过表达chMDA5发现,在体外过表达chDMA5能够显著诱导细胞IFN-β表达,并抑制NDV强毒株F48E9的增殖。应用RNA干扰技术抑制DF-1细胞chMDA5表达发现,抑制细胞中chMDA5表达能够显著抑制细胞IFN-β表达,但对NDVF48E9的增殖无显著影响。2.诱导干扰素表达的chMDA5功能域研究chMDA5由1001个氨基酸残基组成。为了探究其诱导干扰素表达的功能域,根据chMDA5结构将其分为1~328 aa、1~483 aa、1~642 aa、325~1001 aa和全长等5个不同长度的片段,并以pCMV-3HA为骨架构建了5个表达这些chMDA5不同片段的真核表达载体。转染DF-1细胞,Western blot检测发现5个片段均能在DF-1细胞中得到表达。用RT-qPCR方法检测IFN-β表达,发现能诱导鸡IFN-β表达的片段都含有半胱氨酸蛋白酶激活和募集结构域(Caspase activation and recruitment domain,CARD)。1~483 aa和1~642 aa诱导IFN-β表达水平差异不显著,且和全长chMDA5诱导IFN-β表达水平差异不显著。因此,chMDA5的1~483 aa可以作为研究chMDA5诱导IFN-β表达的功能域。3.chMDA5影响NDV对鸡致病性的研究构建并获得了能够表达chMDA5前483 aa的重组腺病毒rAd-MDA5和干扰chMDA5表达的重组腺病毒rAd-shM5。rAd-MDA5感染DF-1细胞后能够介导chMDA5(483 aa)的表达并诱导鸡IFN-β的表达;rAd-shM5感染DF-1细胞后能够显著降低chMDA5和IFN-β的表达,且下调F48E9感染细胞诱导的chMDA5和IFN-β的表达。rAd-MDA5注射鸡体后能够上调宿主chMDA5表达。与单独F48E9感染相比,共感染rAd-MDA5和F48E9能够显著上调F48E9攻毒后鸡体肺脏IFN-β的表达水平,降低肺脏病毒载量,并延长攻毒后鸡群的存活时间。而rAd-shM5注射鸡体后能够在鸡体内抑制chMDA5和IFN-β表达,但对F48E9感染后鸡群的存活时间无显著影响。4.chMDA5辅助激活适应性免疫反应的研究将表达chMDA5(483 aa)的重组腺病毒rAd-MDA5和NDV灭活疫苗共同免疫SPF鸡。免疫后每7天采集血液,用血凝抑制(Hemagglutination Inhibition,HI)方法检测血清抗体水平发现,腺病毒rAd-MDA5表达的chMDA5(483 aa)增强了NDV灭活疫苗诱导的体液免疫。在二免24 h后,采集鸡体脾脏,用RT-qPCR检测IL-4、IFN-γ和MHC-Ⅱ的表达,发现chMDA5(483 aa)增强了鸡体这些细胞免疫相关因子的表达。在鸡体攻毒前采集鸡体外周血,淋巴细胞增殖实验结果表明,chMDA5(483 aa)提高了联合免疫rAd-MDA5和NDV灭活疫苗鸡体的淋巴细胞刺激指数。将鸡体以10~4TCID_(50)/只的剂量感染NDV强毒株F48E9发现,联合免疫rAd-MDA5和NDV灭活疫苗,降低了感染引起的发病率、组织损伤、器官病毒载量和排毒。这些结果表明,chMDA(483 aa)增强了NDV灭活疫苗的免疫效果。综上所述,本研究详细阐述了NDV感染细胞和鸡体后chMDA5和IFN-β的表达规律,研究了chMDA5诱导IFN表达的功能域,阐明了chMDA5对NDV增殖及其对鸡致病性的影响,揭示了chMDA5(483 aa)增强NDV灭活疫苗免疫效果的机制。一方面为进一步研究chMDA5功能提供理论基础,为进一步研究chMDA5帮助宿主抵抗NDV的感染提供依据;另一方面为增强NDV疫苗免疫效果提供了新的方法,也为ND新型疫苗开发提供了候选佐剂。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4
【图文】：

模式图,新城疫病毒,粒子结构,模式图

第一章新城疫病毒感染及鸡体 MDA5 介导天然免疫研究进展构蛋白分别为：核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein, NP）、磷蛋白（P、基质蛋白（Matrix protein, M）、融合蛋白（Fusion protein, F）、酶蛋白（ Hemagglutinin neuraminidase protein, HN）、大分子蛋白（）。F 蛋白和 HN 蛋白为病毒粒子表面的纤突蛋白，NDV 病毒粒子结1 所示（Bruce S. Seal et al. 2000），基因组的各个基因及其编码蛋白功

原理图,转导,和信号,原理图

受体家族胞质内识别 RNA 的感知元件，包括 RIG-Ⅰ、MD58 基因编码的具有 RNA 解旋酶活性的包内 PR带帽的双链或单链 RNA，此外 RIG-Ⅰ还能识别酶催化的由富含AT的双链DNA转录的双链RNt al. 2004; Kato H et al. 2008) 。人的 MDA5 是有酶活性的酶类。MDA5 通常识别长度超过 2000的 LGP2 也叫 RLR-3(RIG-I-like receptor 3, RLRTP 的 RNA 解旋酶。对于很多病毒而言，RIG-ⅠGP2 功能的激活。的结构与信号转导 RIG-Ⅰ具有相似的结构，即有 N 端的 CARD（和 MDA5 介导的 RNA 识别和信号转导原理图(del Toral RNA recognition and signal activation by RIG-I and M

模型图,纤维形成,和信号,模型

第一章新城疫病毒感染及鸡体 MDA5 介导天然免疫研究进展DA5 协作后，一方面更多的 MDA5 成为激活状态进行纤维组装，另的 MDA5 纤维即可完成信号转导(图 1-6)，从而帮助 MDA5 更高效 RNA 信号识别和抗病毒信号传递（Bruns AM et al. 2014；Zhu Q et a别的胞内非自身 RNA 信号传递给接头分子 MAVS，引起磷酸化介interferon regulatory factors, IRF3）和 NF-κb 的活化，这些因子入达，从而激起机体的先天性抗病毒免疫反应（Rodriguez K R et al. 2图 1-3 MDA5 结构域组成(Berke IC et al 2013)Fig.1-3 Domain organization of MDA5(Berke IC et al 2013)

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