猪A型口蹄疫病毒sIgA间接ELISA方法的建立

发布时间：2020-08-27 11:41

【摘要】：口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)主要引起偶蹄兽的口、蹄部出现水疱性疾病为特征的传染性疾病。黏膜分泌性IgA是黏膜免疫的主要效应因子。本研究以A型FMDV T细胞B细胞多表位肽(T,B cell multi-epitope peptides,TB)作为包被抗原,建立猪A型口蹄疫病毒sIgA间接ELISA方法,为评价多表位黏膜免疫疫苗提供配套的检测方法。1.FMDV sIgA间接ELISA检测抗原的制备及鼠抗猪IgA单抗的标记将已构建的T/B多表位重组表达质粒转化BL-21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达出多表位蛋白TB,经SDS-PAGE电泳检测分子量为45 kDa。经Western blot验证,TB蛋白具有良好的反应原性,经镍柱His标签亲和纯化后测定TB蛋白浓度为0.6mg/mL。用辣根过氧化物酶(HRP)标记试剂盒标记鼠抗猪IgA单克隆抗体,获得了鼠抗猪IgA-HRP酶标抗体。2.猪A型FMDV sIgA间接ELISA方法的建立分别以纯化的TB多表位蛋白、口蹄疫病毒AE蛋白、VP1蛋白和灭活病毒抗原作为包被抗原,以鼠抗猪IgA-HRP单克隆抗体为二抗,筛选间接ELISA的最佳条件。结果,最佳包被抗原是TB蛋白,包被浓度3.00μg/mL;最佳封闭液为10m M PBS配制的0.5%BSA;一抗1:2稀释37℃孵育45min;鼠抗猪IgA-HRP单克隆抗体稀释度为1:5000,作用条件为37℃30min,底物室温显色15min。通过计算40份阴性样品酶标仪OD_(450nm)读数的平均值(?X)和标准差(SD)确定阴阳性临界值为0.209;通过对90份A型FMDV感染发病猪的鼻拭子样品检测,敏感性为97.78%;针对A型、O型FMDV交叉感染情况,对84份O型FMDV感染猪鼻拭子样品进行检测,符合率为90.5%,且与猪流行性腹泻、猪瘟、猪圆环、猪繁殖与呼吸道综合征的特异性IgA抗体没有交叉反应。批内和批间重复性试验的变异系数介于1.27%~7.92%,表明该方法具有良好的可重复性。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：

硕士学位,蛋白,室温

业大学 2018 届硕士学位，并在室温（20-25℃）有影响，也可以设置为多）后，每使用 10μl 抗。果表达的 TB 蛋白进行期结果一致（图 2-1）M1 2KDa

-2 TB 蛋白的 Western-Blot estern-Blot analysis of purif1-3：纯化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein盒测定 TB 蛋白浓度，通蛋白浓度为 0.6 mg/mL（

标准曲线,标准曲线,标准蛋白,试剂盒

60KDa40KDa22KDa图 2-2 TB 蛋白的 Western-Blot 分析Figure.2-2 Western-Blot analysis of purified TB protein1-3：纯化后的 TB 蛋白1-3:Purified TB protein2.2 TB 蛋白的纯化结果用蛋白浓度测定试剂盒测定 TB 蛋白浓度，通过 BSA 标准蛋白所做的标曲线比较，最终得出 TB 蛋白浓度为 0.6 mg/mL（图 2-3）。

【相似文献】