GldM蛋白在鸭疫里默氏杆菌致病过程中的作用机制

发布时间：2020-08-28 07:08

鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemrella anatipestifer,RA)引起的一种主要侵害雏鸭、雏火鸡、鹅等多种禽类的急性或慢性、败血性、接触性传染病。感染鸭发病率高达90%、死亡率高达75%,对世界养鸭业造成重大经济损失。RA属于拟杆菌门,黄杆菌属,无鞭毛和菌毛,而拟杆菌门有多种菌都存在滑行运动的现象。基因分析发现RA同样存在着滑行运动基因,同时还存在一整套的新型分泌系统即IX型分泌系统(the type IX secretion system,T9SS)基因,该系统在拟杆菌门中普遍存在且高度保守。在前期研究中我们用转座子随机突变技术筛选到一株Yb2AS87_RS08465基因突变株,发现其毒力显著减弱,但具体的机制并不清楚。基因比对分析发现AS87_RS08465编码细菌滑行运动和IX型分泌系统核心组分蛋白GldM。通过Western blot鉴定到该蛋白位于RA的细胞膜上。琼脂糖凝胶扩散试验证实了野生株Yb2存在着滑行运动,而突变株的滑行运动能力丧失。进一步的研究表明突变株RA2281(又称Yb2ΔgldM)的黏附和入侵细胞的能力显著降低,此外,突变株Yb2ΔgldM感染雏鸭的血液载菌量显著低于相同剂量野生株感染雏鸭的载菌量,表明AS87_RS08465基因对RA感染雏鸭的致病性至关重要。经转录组测序发现,突变株Yb2ΔgldM有15个基因上调表达,其中有6个上调表达倍数在2倍以上、下调表达基因15个,其中有5个下调2倍以上,且部分基因也是IX型分泌系统的组分,提示这些成分之间存在着功能上的联系。本研究表明GldM蛋白与RA滑行运动有关,且对RA感染鸭的致病性有着关键作用。提取野生株Yb2、突变株Yb2ΔgldM和回复株cYb2ΔgldM的分泌蛋白,SDS-PAGE分析发现突变株Yb2ΔgldM在分泌蛋白的丰度和含量上较Yb2和回复株cYb2ΔgldM有很大的区别,Yb2ΔgldM分泌蛋白的酶活试验也证实其酶降解能力显著降低,表明突变株缺失了分泌某些关键酶分子的能力。质谱分析结果显示Yb2ΔgldM的分泌蛋白与Yb2相比,具有显著性的差异,这些差异蛋白有9个含有特异性CTD结构,是IX型分泌系统的分泌底物。基因功能注释显示这9个蛋白很多都是具有催化活性的酶类,可能是RA重要的潜在毒力因子。本研究证明了GldM蛋白与RA的滑行运动、IX型分泌系统及蛋白分泌有关。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

拟杆菌,同源性,基因,周质

spr 及其同源性基因在拟杆菌门中的分布Fig 1.1 Distribution of gld and spr orthologs in completed Bacteroidetes genom(Mcbride and Yongtao, 2013)泌系统力因子的释放有赖于专属的分泌系统，自 1982 年 Goebel W 等(G现革兰氏阴性菌大肠杆菌依赖分泌系统分泌毒力因子溶血素 A 以种蛋白质分泌系统，包括：I 型、II 型、III 型、Ⅳ型、V 型、Ⅵ型泌系统一般都横跨细菌的内膜，周质和外膜，不同分泌系统的分Ⅳ型、Ⅵ型分泌系统的分泌物在胞内合成后可直接穿过细胞膜孔II 型、V 型则是先通过内膜的双精氨酸转运途径（Sec/Tat system至周质，再通过外膜转运系统将底物运送至相应位置，这种方015)，Ⅶ型、Ⅷ型则与细菌的Ⅰ型菌毛和 curli 蛋白分泌有关(De菌的繁殖传播和适应环境有着重要的生理作用，它们能够促进细、抵御宿主的抗菌系统，抵御生物和化学试剂的杀伤以及在真核

滑行运动,约氏,黄杆菌,蛋白

数细菌降解几丁质的关键酶(Rhodes, et al., 2011)。滑行运动研究的深入，人们发现，很多无滑行运动的菌中同样存在着 gld 基码产物，这提示了该类基因存在更多功能上的潜力。牙龈卟啉单胞菌(Por)也是拟杆菌门的成员，但无滑行运动能力，缺乏传统的分泌系统，但该菌分的毒力因子，可引起人的牙周疾病，Keiko S 等通过基因组序列分析和比对泌与十一种蛋白有关，包括 PorK, PorL, PorM, PorN, PorW, PorT, PorX , PorY, rN, PorP 和 Sov 等。有趣的是，这十一个蛋白中有七个蛋白(PorK, PorL, P，PorT) 与约氏黄杆菌的滑行运动相关蛋白在序列上有着极高的相似度，并且缺失后牙龈卟啉单胞菌不能正常分泌牙龈素，而当约氏黄杆菌 porT 的同源基的滑行运动，ChiA 的分泌及细胞表面与滑行运动相关的蛋白 SprB 分泌都出在拟杆菌门中存在着某种特殊的蛋白分泌系统且这种分泌系统和细菌的滑行并将这种分泌系统称之为 Por 分泌系统(PorSS)(Sato, et al., 2010)。2013 年，M性分析比对了拟杆菌门中的几十种菌，发现 Por 分泌系统存在于该门的大多该分泌系统组分在拟杆菌门中高度保守，系统组分和分泌底物特点都与其 I有着显著差异，并与细菌的致病能力相关，因此将其命名为一种新的分泌系，该分泌系统为拟杆菌门所特有(Mcbride and Yongtao, 2013)。

约氏,蛋白,羧基端,黄杆菌

硕士学位论文泌系统之所以区别于其他八种分泌系统，是因为其分泌底物蛋白的方是分泌蛋白氨基端具有信号肽结构，该结构使蛋白能够被内膜 Sec 系周质，另一个更重要的特点是在分泌蛋白的羧基端含有一段大约 60-1称之为 CTDs，该结构在外膜被Ⅸ型分泌系统所识别并切割，从而使胞表面(Abhishek, et al., 2013; Glew et al., 2012; Keiko et al., 2012; Seer表明，所有的CTDs都属于TIGRFAM家族，该家族分为TIGR04131 和统所分泌的外分泌蛋白 ChiA、牙龈素等属于 TIGR04183，也叫 A 型动相关蛋白 SprB、RemA 等属于 TIGR04131，也叫 B 型 CTDs(Abhish012; Mcbride and Yongtao, 2013)。对分泌蛋白来说，CTDs 是分泌蛋白旦蛋白的 CTDs 结构损伤或是Ⅸ型分泌系统损伤，虽然这种损伤并不泌蛋白都不能分泌至胞外，从而造成蛋白在细胞周质内的聚集(Glew, e更多菌种的研究进一步阐明了拟杆菌门的这种新型分泌系统的机制。

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