FABP3对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控及机制研究

发布时间：2020-08-28 07:21

【摘要】：世界性多发性的奶牛乳房炎给奶牛健康、奶业经济带来极大的损害,随着人们对乳制品需求量及品质的不断提高,亟待建立防治乳房炎的有效技术。近年来随着分子生物学技术的发展,分子辅助选择已成为遗传改良与育种的重要手段,其重要基础和前提是掌握有效调控奶牛乳房炎的重要基因或重要分子标记。现有研究利用GWAS分析筛选出一个与奶牛乳房炎显著相关的SNP位点,在该位点周围1Mb范围内存在多个脂肪酸结合蛋白FABP(fatty acid binding protein)家族基因。FABP3(fatty acid binding protein-3)脂肪酸结合蛋白3是细胞内重要的脂肪酸转运蛋白,广泛存在于乳腺、心肌等组织中。FABP3通过介导脂肪酸转运参与脂质代谢、能量代谢、免疫调节等各生命活动。因此,本研究以FABP3基因为研究对象,通过构建脂多糖(LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型,探讨FABP3对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控及其机制。得到主要结果如下:(1)奶牛白细胞(PBL)和乳腺上皮细胞(bMECs)中FABPs表达水平:在奶牛白细胞(PBL)中,FABP3和FABP5高效表达,FABP4、FABP8、FABP9表达量较低;在奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)中,FABP3和FABP4高效表达,FABP5,FABP8和FABP9表达量较低;(2)构建LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎症模型:确认0.5ug/ml和24h为LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞的最佳浓度和时间,且与对照组相比,细胞凋亡水平无明显变化,细胞活性未受影响。即成功构建了LPS刺激乳腺上皮细胞的炎症模型;(3)LPS刺激对奶牛白细胞(PBL)和乳腺上皮细胞(bMECs)中FABP3表达的影响:LPS(0.1ug/ml)诱导奶牛白细胞炎症反应,与对照组相比,3h、9h、12h FABP3的表达水平极显著上升(P0.01),其中12h表达水平最高;LPS(0.5ug/ml)诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中,与对照组相比,12h、24h FABP3表达极显著上升(P0.01),24h的表达水平最高;(4)FABP3在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎症中的作用:LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中,siRNA干扰FABP3表达显著抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达(P0.001);通过构建FABP3超表达载体,过表达FABP3极显著促进IL-6和IL-8的表达(P0.001);同时实验干扰FABP3后,极显著上调过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptors)PPARα蛋白表达(P0.001),极显著抑制LPS诱导的NF-κB-p65磷酸化(P0.001)从而抑制炎症信号通路的激活;(5)不同脂肪酸对FABP3表达及LPS诱导的炎症反应的作用:棕榈酸(饱和脂肪酸)能极显著的促进FABP3的表达(P0.001),且能极显著促进LPS诱导的炎症因子IL-6和IL-8的表达(P0.01);而硬脂酸(饱和脂肪酸)对FABP3和炎症因子的表达无显著影响;油酸(不饱和脂肪酸)能显著的抑制FABP3的表达,且能极显著的抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达(P0.01)。综上所述,FABP3在奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)和外周血白细胞(PBL)中均高效表达,且LPS有效地诱导细胞中FABP3的表达。干扰FABP3表达可通过上调信号通路中关键基因PPARα表达,抑制炎症信号通路NF-κB激活,从而抑制炎症因子IL-6、IL-8的表达,减轻乳腺上皮细胞炎症反应。不同脂肪酸对FABP3表达与LPS诱导的炎症反应有显著影响,其中油酸(不饱和脂肪酸)能显著的抑制FABP3的表达及细胞炎症反应。本实验结果为研究奶牛乳房炎相关免疫机理、防治奶牛乳房炎提供了新的实验依据和理论参考。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：

信号通路,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,白细胞介素

-κB 和 AP-1 等炎症信号通路，促进趋化因子（如肿瘤坏死因子（素-8（IL-8））和细胞因子（如白细胞介素 1β（IL-1β）、白细胞介素放(陈星 2016)。细胞因子的释放可进一步放大刺激信号促进免疫反子负责招募免疫效应细胞如中性粒细胞(PMN)等迁移至感染的部位房的细菌，同时释放蛋白酶和氧化剂来加快细菌的死亡(敬晓棋 et a动炎症反应杀死病原体的同时，炎症区域的血管通透性增大，血流的凝固因子和炎症介质如白细胞三烯、组织胺等渗透到组织中，。乳腺感染造成的大量泌乳细胞和白细胞坏死，堵塞乳导管更加重对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌产生的免疫应答反应是不同的。革常诱发临床型的乳房炎，其主要刺激物为病原体细胞壁脂多糖（LP现为临床特征明显，经常导致奶牛的死亡。革兰氏阳性菌通常诱发，持续时间长，无发热等临床特征(Bannerman et al 2004)。

结构图,结构图,乳铁蛋白,分子

图 1-2 LPS 结构图(Guha et al 2001). 1-2 The structure of LPS(Guha et al 2糖（Lipopolysaccharides，LPS）刺关分子模式（PAMPs），激活 TLR（IL-6、IL-8、TNF-α、乳铁蛋白等

结构图,信号通路,受体,白细胞介素-1

图 1-2 LPS 结构图(Guha et al 200Fig. 1-2 The structure of LPS(Guha et a多糖（Lipopolysaccharides，LPS）相关分子模式（PAMPs），激活 T子（IL-6、IL-8、TNF-α、乳铁蛋白S 的主要受体，这一过程需要多种形式发挥作用，依赖MD-2识别LPP（LPS binding protein）是一种可直分子 CD14 结合。与 CD14 结合的的一个与白细胞介素-1 受体（IL-1到关键作用，与下游分子 MyD8号通路包括 MyD88-依赖途径和 M

【参考文献】