硫氧还蛋白还原酶抑制剂对田鼠巴贝斯虫生长代谢的影响

发布时间：2020-08-28 14:38

　　田鼠巴贝斯虫(Babesia microti)是一类以硬蜱为传播媒介,寄生在哺乳动物红细胞的顶复门原虫,是重要的人兽共患巴贝斯虫病的病原。作为一新发疾病,目前的主要防治手段是阿托伐醌和阿奇霉素等联合用药,但是鉴于存在耐药性和一系列副反应的问题,有必要筛选潜在的药物靶标,开发新的抗虫药物。田鼠巴贝斯虫寄生于高氧和高铁环境的红细胞中,需要积极应对胞内恶劣的氧化压力。硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase,TrxR)是维持氧化还原平衡的重要效应蛋白,本实验室前期已鉴定田鼠巴贝斯虫仅存在一种TrxR,是重要的药物靶标分子。因此本研究开展TrxR抑制剂对田鼠巴贝斯虫及其蛋白质组学变化的影响,以期探索TrxR在虫体生长代谢的作用机制,为新型抗虫药物的研制提供基础。本研究内容包括以下四个方面:一、通过比较田鼠巴贝斯虫的TrxR和宿主TrxR还原DTNB的酶活能力,和四种抑制剂对TrxR抑制效果比较,筛选对宿主酶影响较小,但对虫体酶影响最大的抑制剂。结果发现IC50(田鼠巴贝斯虫的TrxR,11.70μM)IC50(宿主TrxR,50.77μM),表明4-NBT可以作为田鼠巴贝斯虫TrxR的特异性抑制剂。二、建立B.microti体外短期培养体系。通过CCK8和红细胞溶血实验检测4-NBT的细胞毒性。体外SYBR GREEN法和体内再攻虫法检测B.microti的生长状态,从而判定4-NBT的抗虫效果。通过TUNEL法观察到4-NBT处理组的虫体发生蓝绿荧光共定位,表明虫体基因组DNA发生断裂。三、提取4-NBT处理的全虫蛋白,检测发现TrxR酶活比发生下降,说明天然虫源TrxR可以被4-NBT抑制。使用流式细胞术评估虫体孵育4-NBT的ROS变化水平,发现4-NBT可以显著提高B.microti的ROS水平。此外,4-NBT处理的全虫蛋白的丙二醛和蛋白羰基化水平显著高于DMSO处理的全虫蛋白,表明经4-NBT处理的B.microti发生氧化损伤,处于氧化应激状态。四、4-NBT和DMSO分别与体外培养的B.microti孵育,TrxR活性受到抑制后通过Label-free定量蛋白质组学技术比较虫体蛋白表达差异。总共鉴定到1113个蛋白,发现体外培养2天的蛋白质组上调蛋白180个,下调蛋白37个。体外培养5天的蛋白质组上调蛋白50个,下调蛋白80个。通过对差异蛋白的GO功能注释和KEGG分析,发现对核糖体,内质网中的蛋白质加工,蛋白酶体相关蛋白等,受TrxR失活的影响显著。此外,从氧化应激的角度分析,B.microti蛋白质,核酸,脂质的代谢处于异常状态。综上所述,本研究就B.microti TrxR及其特异性抑制剂4-NBT在寄生虫生长代谢方面的作用及其分子机制展开研究,发现TrxR失活后B.microti处于氧化应激状态,活力和感染力丧失,最终走向凋亡。定量蛋白质组学发现核糖体,蛋白酶体,内质网中的蛋白质加工相关蛋白受TrxR抑制的影响显著,虫体代谢紊乱。这些发现揭示了TrxR在B.microti红内期存活的必要性,为抗虫药物及其疫苗的研制提供理论参考。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.723
【部分图文】：

着底,浓度,反应体系

eductase activity o图 2-1 重组 BTrxR 蛋白的纯化Fig.2-1 Purification of recombinant BTrxRR 的浓度为 150 nM，RTrxR 的浓度。在该反应体系下，加入 DTNB 着底物的消耗，TNB 的生成，光吸

曲线,酶活性,浓度,酶活

图 2-1 重组 BTrxR 蛋白的纯化Fig.2-1 Purification of recombinant BTrxR酶活反应中 BTrxR 的浓度为 150 nM，RTrxR 的浓度为 50 nM，它们曲线如图 2-2 所示。在该反应体系下，加入 DTNB 后，反应即开始进需要 30 分钟。随着底物的消耗，TNB 的生成，光吸收值在 412nm处。

关系曲线,金诺芬

农业科学院硕士学位论文第二章田鼠巴贝斯虫 TrxR 抑制剂的筛选4.2 金诺芬的抑制效果比较金诺芬对两种不同来源酶催化活性的抑制效率与浓度的关系曲线如图 2-3 所示。金诺芬是已的 TrxR 的高效抑制剂，在低纳摩尔摩尔浓度下即表现出对 TrxR 的高效抑制性。试验结果表明，rxR 对金诺芬更敏感，其 IC50 仅是 4.24nM。BTrxR 随着金诺芬浓度的升高，抑制水平升高， IC50 为 88.59nM。

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