Cpx双组份系统在TolC影响ExPEC生物被膜形成中的作用研究

发布时间：2020-08-28 21:10

　　肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)是一类特殊的人兽共患和食源性病原菌,它存在于正常的肠道菌群中,但却能够导致机体其他部位感染,引起尿道炎、感染性肺炎、新生儿脑膜炎等,严重威胁着人和动物的健康。有效疫苗的缺乏、耐药性的增加和生物被膜的形成给ExPEC防控带来了巨大的困难。生物被膜(Biofilm)是细菌的一种特殊生存形式。与浮游菌不同,生物被膜能够抵御机体的免疫清除作用,导致抗生素和消毒剂的作用效果下降,引起机体感染的反复发生。在食品加工设备和食品原料表面的生物被膜给食品安全造成严重危害。因此,研究生物被膜形成机制和控制对策具有重要意义。外膜蛋白TolC是构成革兰氏阴性菌外排泵的重要的成分,是细菌对多种抗菌药的抗性的重要原因。本实验室前期研究表明TolC蛋白缺失会造成ExEPC在M9高渗培养基中Curli菌毛合成能力降低和生物被膜形成能力降低,转录组学分析发现TolC缺失后会引起Cpx双组份系统周质间隙蛋白CpxP编码基因的上调表达。Cpx双组份系统可响应细菌对高渗信号的识别,激活后能够抑制Curli菌毛的合成,因此Cpx系统可能在tolC缺失后影响ExPEC生物被膜形成中发挥作用。本研究通过对△tolC菌株中Cpx双组份系统感应蛋白CpxA和效应蛋白CpxR进行突变,探究其在△tolC菌株影响生物被膜形成中的作用。主要研究内容和结果如下:1.基因缺失菌株的构建设计引物以ExEPC PPECC42基因组为模板扩增cpxA上下游同源臂,并通过Overlap PCR方法连接,将同源臂插入自杀性载体pRE112,转化大肠杆菌χ7213感受态细胞构建χ7213-pRE-△cpxA。并以此为供体菌,分别以ExEPC PPECC42野生株及△tolC株为受体菌进行同源重组,利用Cm和SacB筛选得到△cpxA基因缺失株和△tolC△cpxA双基因缺失株。利用同样方法,构建△cpxR基因缺失株和△tolC△cpxR双基因缺失株。2.回补菌株和CpxA磷酸化位点定点突变菌株的构建以PPECC42基因组为模板,设计引物扩增cpxA基因全长,并插入pHSG396质粒,构建pHSG-cpxA表达载体,电转化至△tolC△cpxA菌株中,构建回补菌株CmA-△tolC△cpxA。运用同样的方法构建出Cm-R-△tolC△cpxR。通过预测和翻译分析,找出CpxA磷酸化位点对应的核酸序列位点,设计点突变引物以pHSG-cpxA质粒为模板扩增出突变的质粒,测序鉴定后电转化△tolC△cpxA菌株中,以构建CpxA磷酸化位点突变菌株M-A-△tolC△cpxA。3.实验菌株的部分生物学特性研究首先测定试验菌株的生长情况,在M9和1/2M9培养基中tolC、cpxA和cpxR基因的缺失对ExPEC的生长速率无影响,试验菌株在8h后可以达到稳定期。其次使用7种抗菌药测定了试验菌株的MIC,结果表明△tolC和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR菌株对氯霉素和环丙沙星的敏感性显著升高,而cpxA和cpxR单缺失对这7种抗菌药的敏感性并未发生明显变化。4.试验菌株生物被膜形成能力分析使用结晶紫染色法测定试验菌株生物被膜形成能力,发现在M9高渗培养基中与WT相比△tolC菌株生物被膜形成能力显著下降;双基因缺失株△tolC△cpxA、△tolC△cpxR与WT相当;回补菌株Cm-A-△tolC△cpxA和Cm-R-△tolC△cpxR生物被膜形成能力恢复到△tolC的水平;M-A-△tolC△cpxA生物被膜形成能力与WT一致。而上述菌株生物被膜形成能力在1/2M9培养基中均无差异。在1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖培养基中试验菌株的生物被膜形成能力与M9中类似。5.扫描电子显微镜观察生物被膜细菌微观形态使用扫描电镜观察试验菌株生物被膜细菌微观形态发现在1/2M9+0.06 mol/L NaCl、1/2M9+0.8%蔗糖的高渗培养基中△tolC△cpxA、△tolC△cpxR和M-A-ΔtolCΔcpxA均呈现与WT相似大量黏附于玻片表面,且菌体之间存在大量黏连,但△tolC菌株在玻片上黏附较少,细菌菌体之间黏连情况也较少。6.Curli菌毛合成能力分析刚果红平板试验表明在M9和1/2M9+0.06mol/L NaCl和1/2M9+0.8%蔗糖的CR培养基中,△cpxA和△cpxR单基因缺失突变株和△tolC△cpxA、△tolC△cpxR双基因缺失株能够形成与野生型菌株WT类似的rdar菌落形态,而Cm-A-△tolC△cpxA、Cm-R-△tolC△cpxR的菌落形态与△tolC株相似,M-A-ΔtolCΔcpxA则可以形成与WT类似的菌落。在1/2M9-CR平板上试验菌株的菌落形态均与WT相似。这表明Cpx双组份系统确实在高渗条件下ΔtolC菌株引起生物被膜形成能力下降的过程中发挥了作用,而且是通过抑制Curli菌毛合成而影响的。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

质粒,图谱,菌株,大肠杆菌

2. 材料与方法2.1. 材料2.1.1. 菌株与载体大肠杆菌 PPECC42 野生株，血清型 O11，属于 B2 群菌株，分离自湖南华猪肺脏，分离时间 2006 年 7 月，小鼠毒力试验表明为强毒力菌株，基因组全序经测定（GeneBank ID: NZ_CM003707.1），由本实验室分离保存。大肠杆菌 DH5α，χ7213 由本实验室保存。互补质粒 pHSG396 均购自 Takara本）有限公司，其限制性图谱见图 2-1；自杀性载体 pRE112 由病毒室保存，其性图谱见图 2-2，本研究所使用的所有菌株和质粒见表 2-1。

图谱,菌株,大肠杆菌,毒力试验

示意图,基因,示意图,产物

图 2-3 cpxA 基因上下游同源臂重叠示意图Fig 2-3 cpxA gene upstream and downstream homology arm splicing by overlap extension PC2.2.6.4. 重组自杀性质粒 pRE-△cpxA 的构建将上步回收 PCR 产物和提取的 pRE112 质粒使用 SacⅠ 和 KpnⅠ进行双酶切，酶切 3h，之后使用 0.8%琼脂糖凝胶电泳回收片段，然后使用 T4DNA 连接酶片段与载体进行连接，条件为16℃连接10-12h。酶切反应体系和连接反应体系如酶切体系：PCR 回收产物或载体 10μLKpnΙ 1μLSacΙ 1μLBuffer 2μLddH2O 6μL连接体系：酶切目的基因ΔcpxA 回收产物 6μL酶切载体 pRE112 回收产物 2μL

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