基于牛源布鲁氏菌外膜蛋白胶体金试纸条的研制

发布时间：2020-08-31 13:56

　　布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种发病率较高的人畜共患性疾病,其对公共卫生造成严重的影响,故而对于该菌的检测及防控显得尤为重要。为了探索布鲁氏菌快速检测技术,本研究以布鲁氏菌外膜蛋白诱导纯化为基础,进行了牛源布鲁氏菌胶体金试纸条的研制,具体如下:本研究将布鲁氏菌三种重组质粒pCold-TF-OMP19、pCold-TF-OMP22和pCold-TF-OMP28分别转化至E.coli BL21感受态细胞中进行诱导表达,经亲和层析及离子交换柱技术纯化后,通过SDS-PAGE分析、ELISA方法及Western blot技术对重组蛋白OMP19、OMP22及OMP28进行鉴定,其后使用试剂盒(BCA)测定蛋白浓度。结果表明重组蛋白OMP19、OMP22和OMP28大小分别为69 KDa、74 KDa和80 KDa,均为可溶性蛋白;经阴离子交换柱纯化后,重组蛋白的纯度均达到85%以上;采用ELISA及Western blot方法鉴定重组蛋白,结果表明三种重组蛋白均有良好免疫原性和反应活性;重组蛋白OMP19、OMP22和OMP28经BCA试剂盒检测浓度分别为1.1mg/mL、1.5mg/mL、1.3mg/mL。使用已纯化的重组蛋白OMP22免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,通过ELISA方法对制备好的多抗进行效价的测定。结果表明,采用ELISA方法检测到多克隆抗体的效价为1:102400,经SDS-PAGE电泳结果鉴定得到高纯度的多克隆抗体,使用试剂盒(BCA)检测到多克隆抗体的浓度为1.8 mg/mL。通过柠檬酸盐还原法制备35nm胶体金溶液,然后将纯化的单个OMP22蛋白和OMP19、OMP22、OMP28三种蛋白混合物分别作为胶体金标记物,兔抗牛IgG及制备好的OMP22多克隆抗体分别作为检测线与质控线,并对牛源布鲁氏菌胶体金免疫层析试纸条检测方法的反应体系及条件进行优化。结果显示,OMP22蛋白制备的胶体金试纸条在标准阳性血清稀释至32倍时仍可见清晰条带,在牛源布鲁氏菌标准阳性血清稀释至64倍时,标记蛋白混合物制备的胶体金试纸条仍可见清晰条带;制备的两种试纸条与牛源的结核病、病毒性腹泻病、蓝舌病、口蹄疫、地方流行性白血病、巴氏杆菌病阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒比较,OMP22蛋白和蛋白混合物制备的试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率分别为94.2%(49/52)、90.3%(47/52),与牛羊布病抗体检测卡(KERNEL)的符合率为98%(49/50)、94%(47/50)。本研究中,制备的试纸条检测快速、简单,可用于现场检测布鲁氏菌中的抗体。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

重组质粒,质粒

图 1 重组质粒转化Fig.1 Transformations of restructuring plasmids图 2 重组质粒 PCR 扩增Fig.2 PCR amplificat of restructuring plasmidsM:DNA 分子质量标准；1:pCold-TF-OMP19 质粒；2:pCold-TF-OMP22 质粒3:pCold-TF-OMP28 质粒M:DL2000 DNA Marker;1:pCold-TF-OMP19 plasmid;2:pCold-TF-OMP22 plas

质粒,重组质粒,PCR扩增,蛋白

18图 2 重组质粒 PCR 扩增Fig.2 PCR amplificat of restructuring plasmidsA 分子质量标准；1:pCold-TF-OMP19 质粒；2:pCold-TF-OMP223:pCold-TF-OMP28 质粒00 DNA Marker;1:pCold-TF-OMP19 plasmid;2:pCold-TF-OMP22 pCold-TF-OMP28 plasmid蛋白 OMP19、OMP22、OMP28 的 SDS-PAGlot 分析的鉴定2.6 方法进行，结果表明诱导表达的重组蛋白 OMP19大小为 52 KDa 的 pCold-TF 载体标签）大小分别为 69并均为可溶性表达，蛋白条带大小与预期一致。经 BCAMP19、OMP22 和 OMP28 浓度分别为1.1mg/mL、1.5mg/m

重组蛋白,布鲁氏菌,反应原性,组蛋白

图 3 a:SDS-PAGE 电泳鉴定 b: Western blot 分析1-3:重组蛋白分别为 OMP19、OMP22、OMP28；M:蛋白分子质量Fig.3a: SDS-PAGE analysis b:Analysis of western blo1-3:Purified recombinant proteinOMP19、OMP22、OMP28 respectively; M:Prweight Marker3.3 ELISA 对重组蛋白 OMP19、OMP22、OMP28 的鉴按照 2.7 的方法进行重组蛋白间接 ELISA 试验，参照张晓娟等验检测布鲁氏菌阳性值最低作为判定标准，当 S/P≥X+3SD=0.25 时，结果表明，本试验检测结果与 IDEXX 试剂盒相符，同时验证了布鲁白 OMP19、OMP22、OMP28 具有很好的反应原性，说明三种重组蛋断抗原应用于牛布鲁氏菌胶体金试纸条试验（表 2）：

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