如何通过营养手段改善母猪卵泡发育和繁殖力是养猪生产中面临重要任务。研究发现在卵泡发育过程中,卵母细胞DNA甲基化发生剧烈改变,且DNA甲基化可以通过调控卵泡发育关键基因表达,进而影响卵泡发育。日粮中甲基供体是调控机体DNA甲基化最有效的物质。前人研究发现给哺乳动物或育龄妇女食物中补充甲基供体(比如:叶酸,VB_(12)等)能显著改善卵泡发育和卵母细胞质量,但具体机制尚不清楚。雌性动物卵巢原始卵泡库大小决定其终生繁殖潜力。甲基供体是否能影响雌性哺乳动物原始卵泡生长和发育,目前也不清楚。基于此,本论文旨从调控卵巢DNA甲基化方面系统研究妊娠泌乳母猪和后备母猪饲粮中补充甲基供体对卵泡生长发育的影响及可能机制。主要研究内容及结果如下:试验一妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体对母猪繁殖性能和后代卵泡发育的影响及其机制研究本试验拟通过在妊娠和泌乳母猪饲粮中(原始卵泡库形成关键期)添加甲基供体研究母猪繁殖性能和后代卵泡发育的影响及机制。试验采用2×2因子设计,选用5-7胎LY母猪48头,配种后按照胎次、体重和背膘分配至4个处理组。每个处理12个重复,每个重复1头猪。4个处理组分别为:(1)对照组(CON):基础日粮组(满足NRC(2012)营养需求);(2)甲基供体组(MET):基础日粮+甲基供体;(3)双酚A组(BPA):基础日粮+BPA;(4)双酚A+甲基供体组(BPA+MET):基础日粮+甲基供体+BPA。试验处理时间为配种开始到断奶结束。妊娠期采用限饲(0-90d:2.28kg/d;90d-分娩:2.72kg/d),试验处理方式为将甲基供体或BPA添加到妊娠基础日粮(甲基供体添加剂量:3 g/kg甜菜碱+400 mg/kg胆碱+15 mg/kg叶酸+150μg/kg VB_(12);BPA添加剂量:50mg/kg)。母猪分娩后,调整母猪带仔数为9-11头。泌乳期采食量标准:1-5 d(2,2.5,3.5,4.5,5.5kg/d),6-28 d(自由采食)。为了保证每头母猪摄入充足甲基供体或BPA。泌乳期处理方式如下:每天早上8点先饲喂含有甲基供体复合物(甜菜碱:29.66mg/kg.BW,叶酸:0.15mg/kg.BW,VB_(12):0.0014mg/kg.BW,胆碱:3.95mg/kg.BW)或者BPA(0.49mg/kg.BW)粉末拌匀的0.5kg饲料,然后给予同一泌乳基础日粮饲喂至断奶,泌乳期共计4周。断奶后,每个处理随机选择12头接近窝平均体重的断奶小母猪,共计48头转至保育舍(每组6个重复,2头/重复),饲喂同一基础日粮至第三个发情期第19天。断奶-80kg:自由采食;80kg-屠宰:2.5kg/d。150日龄开始用公猪诱情(2次/天),监测初情启动。分别于断奶当天(断奶)和第三个发情期第19天(成年)屠宰取血样和卵巢样。结果表明:1、妊娠和泌乳饲粮中添加甲基供体不影响母猪妊娠110d体重、总产仔数、活产仔数、初生个体重和窝重(P0.05),但降低木乃伊和畸形率(P0.05)。妊娠和泌乳饲粮中添加BPA降低总产仔数(P0.05)、活产仔数(P=0.07)和初生窝重(P0.05),但对初生个体重无显著影响。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体增加断奶仔猪头数和断奶窝重(P0.05),但对母猪泌乳期失重、平均每日采食量和断奶发情间隔无显著影响(P0.05)。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加BPA降低仔猪第21、28天个体重和窝重(P0.05)。2、妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体或BPA对后代初情日龄、体重、背膘、情期间隔和卵巢体重比无显著影响(P0.05)。在后代断奶仔猪卵泡发育方面,妊娠和泌乳饲粮中添加甲基供体显著降低后代卵巢凋亡卵泡比例(P0.05),但对原始、初级和次级卵泡比例无显著影响(P0.05);妊娠和泌乳饲粮中添加BPA显著降低原始卵泡比例,增加初级卵泡和凋亡卵泡比例(P0.05)。在后代青年母猪卵泡发育方面,妊娠和泌乳饲粮中添加甲基供体显著增加后代卵巢原始卵泡比例,以及大卵泡(直径≥5mm)和黄体数目(直径≥3mm)(P0.05),显著降低凋亡卵泡和初级卵泡比例(P0.05);妊娠和泌乳饲粮中添加BPA显著增加凋亡卵泡比例(P0.05)。3、妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著降低分娩、断奶母猪和后代断奶仔猪血清HCY浓度(P0.05),显著增加后代断奶仔猪血清中SAM水平和SAM/SAH比值(P0.05)。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加BPA对分娩、断奶母猪血清HCY浓度,以及后代断奶仔猪血清HCY、SAM浓度和SAM/SAH比值无显著影响(P0.05)。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体或BPA均不影响后代断奶仔猪和青年母猪血清中雌二醇和孕酮浓度(P0.05)。4、在后代断奶仔猪卵巢卵泡发生、一碳代谢和DNA甲基化相关基因和蛋白表达方面,妊娠和泌乳饲粮中添加甲基供体上调后代卵巢BMP15(P0.05)、GDF-9(P=0.08)、MTHFR(P0.05)、MS(P=0.08)、BHMT(P=0.08)和GNMT(P=0.05)mRNA表达量,显著增加DNMT3a mRNA和蛋白表达量(P0.05),且存在交互效应(mRNA:P=0.08;蛋白:P=0.01),显著降低BAX基因和蛋白表达量(P0.05),且存在交互效应(mRNA:P=0.01;蛋白:P=0.02);妊娠和泌乳母猪饲粮中添加BPA显著下调后代卵巢DNMT3a mRNA和蛋白表达量(P0.05),显著增加BAX基因和蛋白表达量(P0.05),但对一碳代谢相关基因的表达无显著影响(P0.05)。在后代青年母猪卵巢卵泡发生、一碳代谢和DNA甲基化相关基因和蛋白表达方面,妊娠和泌乳饲粮中添加甲基供体显著上调后代卵巢Bcl-2和GDF-9基因表达量(P0.05),下调Bim基因以及BAX基因和蛋白表达量(P0.05),但对一碳代谢相关基因表达无显著影响(P0.05)。妊娠和泌乳饲粮中添加BPA下调后代卵巢BAX基因(P0.05)和蛋白(P=0.05)表达量,但对一碳代谢相关基因表达无显著影响(P0.05)。5、妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著增加后代断奶仔猪和青年母猪卵巢DNA总甲基化程度(P0.01),以及卵巢BAX基因启动子区平均DNA甲基化程度(P0.01)。妊娠期和泌乳母猪饲粮中添加BPA显著降低后代断奶仔猪和青年母猪卵巢DNA总甲基化程度(P0.05),以及卵巢BAX基因启动子区平均DNA甲基化程度(P0.01)。在后代断奶仔猪卵巢BAX基因启动区CpG位点方面:妊娠和泌乳期母猪饲粮中添加甲基供体显著上调后代卵巢CpG 3,CpG 18-19,CpG 44-45位点DNA甲基化程度,且有交互效应(P0.05),有提高CpG 9位点DNA甲基化程度的趋势(P=0.07)。妊娠期和泌乳期母猪饲粮中添加BPA显著降低后代卵巢CpG 3,CpG 18-19,CpG 44-45,CpG 8,CpG 24-25位点DNA甲基化程度,且在CpG 3,CpG18-19,CpG 44-45位点有交互效应(P0.05)。在后代青年母猪卵巢BAX基因启动区CpG位点方面:妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著上调后代卵巢CpG 1-2,CpG 33-34,CpG 5-6,CpG18-19,CpG 48-49位点DNA甲基化程度,且在CpG 48-49位点有交互效应(P0.05)。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加BPA显著下调后代卵巢CpG1-2,CpG 3,CpG 33-34,CpG 5-6和CpG 48-49位点DNA甲基化程度,且在CpG 48-49位点有交互效应(P0.05)。本研究结果表明,妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著降低母猪死胎和木乃伊发生率,增加断奶头数和窝重。可能与甲基供体降低母猪血清HCY水平,进而减弱胚胎毒性有关。此外本试验还发现妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著增加后代卵巢原始卵泡比例和大卵泡数目,降低凋亡卵泡比例。其原因与甲基供体降低母猪和后代断奶仔猪血清HCY水平,继而上调后代断奶仔猪血清SAM水平,进而介导DNA甲基化持续下调后代卵巢BAX基因表达密切相关。试验二饲粮中添加甲基供体对后备母猪卵泡发育的影响及机制研究试验一研究结果表明妊娠和泌乳母猪饲粮中(原始卵泡库形成关键期)添加甲基供体改善后代卵巢卵泡发育,且DNA甲基化在其中发挥重要作用。在后备母猪饲粮中(卵泡生长关键期)添加甲基供体是否也能改善卵泡发育呢?试验采用2×2因子设计,试验选用28日龄体重相近(7.43±0.38 kg)LY母猪48头,随机分配到4个处理组中:对照组(CON)、甲基供体组(MET)、双酚A组(BPA)和双酚A+甲基供体组(BPA+MET)。每个处理6个重复,每个重复2头小母猪。甲基供体和BPA供给方式:每天早上8点先分别饲喂甲基供体、BPA、甲基供体BPA丸子后饲喂同一基础日粮。甲基供体和BPA剂量同试验一泌乳阶段。试验持续时间、采食量标准和屠宰取样时间同试验一后代青年母猪。结果表明:1、饲粮中添加甲基供体显著增加后备母猪第90天、180天平均个体重,28-90天、全期日增重以及28-90天平均采食量(P0.05)。饲粮中添加BPA显著降低后备母猪第90天、150天平均个体重,28-90天和全期日增重,以及增加90-150天和全期料比(P0.05)。2、饲粮中添加甲基供体或者BPA显著推迟后备母猪初情启动(P0.05),但对发情间隔无显著影响(P0.05)。饲粮中添加甲基供体显著增加母猪初情体重(P0.05)。饲粮中添加甲基供体增加后备母猪卵巢大卵泡(直径≥5mm)(P0.05)和黄体(直径≥3mm)(P=0.06)数目,以及原始卵泡(P=0.09)和次级卵泡(P=0.08)比例。饲粮中添加BPA降低后备母猪卵巢大卵泡数目(直径≥5mm)(P0.05)和原始卵泡比例(P=0.08),且增加凋亡卵泡比例(P=0.05)。3、饲粮中添加甲基供体显著增加后备母猪血清和卵泡液中SAM浓度和SAM/SAH比值,降低血清和卵泡液中HCY浓度(P0.05)。饲粮中添加BPA有降低后备母猪血清中SAM/SAH比值的趋势(P=0.09)。饲粮中添加甲基供体显著增加后备母猪血清和卵泡液中雌二醇浓度(P0.05)。饲粮中添加BPA降低后备母猪血清(P=0.07)和卵泡液(P0.05)中雌二醇浓度。饲粮中添加甲基供体或BPA对后备母猪血清中孕酮浓度无显著影响(P0.05)。4、饲粮中添加甲基供体显著增加后备母猪卵巢Cyp19A1、ERβ基因mRNA和蛋白表达量(P0.05),且上调卵巢Cyp17A1、MS、MTHFR、DNMT1和DNMT3a基因mRNA表达量(P0.05),但对Cyp17A1蛋白表达量无显著影响(P0.05)。饲粮中添加BPA显著降低后备母猪卵巢Cyp19A1m RNA和蛋白表达量(P0.05),以及ERβ蛋白表达量(P0.05),同时下调DNMT1和DNMT3a基因表达量(P0.05)。5、饲粮中添加甲基供体显著增加后备母猪卵巢总DNA甲基化和Cyp19A1基因启动子区平均DNA甲基化程度(P0.05)。饲粮中添加BPA降低后备母猪卵巢总DNA甲基化程度(P0.05),以及Cyp19A1基因启动子区平均DNA甲基化程度(P=0.058)。饲粮中添加甲基供体显著上调后备母猪卵巢CpG 1,CpG 2和CpG 4位点DNA甲基化程度。饲粮中添加BPA显著降低后备母猪卵巢CpG 1,CpG 2和CpG 4位点DNA甲基化程度,且在CpG 1和2位点有交互效应(P0.05)。本研究结果表明,后备母猪饲粮中添加甲基供体显著增加初情体重和卵巢大卵泡数目。分析其原因可能是甲基供体降低后备母猪血清HCY水平,继而增加血清SAM水平,诱导卵巢Cyp19A1基因启动区高甲基化,上调该基因表达,合成更多雌二醇,进而激活E_2-ERβ通路,促进卵泡生长发育。试验三同型半胱氨酸对体外培养新生小鼠卵巢发育的影响及机制研究试验一和二结果表明母猪饲粮中添加甲基供体能改善卵泡发育,可能与机体HCY水平降低,进而诱导卵泡发育和类固醇合成相关基因DNA甲基化模式发生高甲基化有关。HCY是否能诱导卵巢DNA低甲基化,从而影响其卵泡发育,目前尚未见报道。首先,我们采用100μM HCY处理体外培养新生小鼠卵巢,结果发现显著降低新生小鼠卵巢原始卵泡比例,增加次级和凋亡卵泡比例,以及降低培养基中雌二醇浓度(P0.05)。说明HCY诱导卵巢原始卵泡激活过早启动,加速卵巢发育。采用RT-PCR和western blot检测与卵泡发生和类固醇发生相关的基因和蛋白表达,结果发现HCY显著上调新生小鼠卵巢BAX基因mRNA和蛋白表达量,下调Cyp19A1和ERβ基因mRNA和蛋白表达量,此外也上调BMP15mRNA表达量(P0.05)。说明HCY通过调控卵巢卵泡凋亡和雌二醇合成关键酶基因表达介导卵泡发育。HCY过量堆积能引起一碳代谢过程中其它代谢产物含量变化。我们研究结果也表明HCY增加培养基中SAH浓度,降低SAM:SAH比率(P0.05)。表明HCY可能诱导新生小鼠卵巢低甲基化。同时我们也检测了Bax和Cyp19A1基因启动区DNA甲基化程度。结果发现HCY显著降低卵巢BAX基因启动区平均DNA甲基化程度,以及CpG2和11位点的DNA甲基化程度(P0.05),但对卵巢Cyp19A1基因启动区平均DNA甲基化程度无显著影响(P0.05)。为了进一步验证HCY能诱导卵巢DNA低甲基化,我们采用DNA甲基转移酶抑制剂(5-Aza)和HCY处理新生小鼠卵巢,试验结果显示Hcy或5-Aza或共同添加都显著降低新生小鼠卵巢总DNA甲基化程度(P0.05),以及DNMT3a mRNA和蛋白表达量(P0.05)。说明HCY诱导新生小鼠卵巢DNA低甲基化,从而调控卵泡发育关键基因表达,进而影响卵泡发育。由以上结果可知,HCY增加体外培养新生小鼠培养基SAH水平,介导卵巢BAX基因启动区CpG2和CpG11位点低甲基化,进而上调BAX基因和蛋白表达,诱导早期卵泡凋亡,降低原始卵泡比例。此外HCY可能通过下调Cyp19A1和ERβ基因和蛋白表达,降低雌二醇合成,抑制E_2-ERβ通路,诱导早期卵泡凋亡,降低原始卵泡比例。综上所述,本论文的主要结论为:(1)妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体显著降低木乃伊和畸形发生率,提高断奶头数和窝重。分析其原因与甲基供体降低机体HCY水平,进而减弱胚胎毒性有关。妊娠和泌乳母猪饲粮中添加甲基供体降低母猪和后代断奶仔猪血清中HCY水平,继而引起后代断奶仔猪血清SAM水平升高,介导后代卵巢BAX基因启动区高甲基化,从而下调该基因表达,降低卵巢凋亡卵泡发生率,且这种DNA甲基化修饰模式可以延续到成年阶段。(2)后备母猪饲粮中添加甲基供体降低机体血清HCY水平,继而引起机体SAM水平升高,介导卵巢Cyp19A1基因启动区高甲基化,从而上调该基因表达,促进雌二醇合成,激活E_2-ERβ通路,促进卵泡生长,进而增加大卵泡数目。(3)HCY介导新生小鼠卵巢BAX基因启动区低甲基化,上调该基因表达,增加凋亡卵泡发生率,降低原始卵泡比例。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S828.5
【部分图文】：
原始卵泡池作为雌性动物卵泡发育的基础，一旦被激活，卵泡将面临三种结局：（1）保持静默状态，在整个繁殖生命中等待被唤醒；（2）原始卵泡在外部营养因子作用下被激活进入生长阶段。卵母细胞体积增加，单层颗粒细胞由扁平变为立方体形成初级卵泡。卵母细胞继续增大伴随颗粒细胞增殖为两层形成次级卵泡。颗粒细胞增殖达到 6-7 层后形成腔前卵泡。一旦卵泡达到特定尺寸，卵泡内部将形成充满液体的卵泡腔，转变为有腔卵泡。最终在 LH 峰值作用下排出成熟的卵丘-卵母细胞复合物。在卵泡生长阶段，卵母细胞停滞在第一次减数分裂前期。在排卵前 LH 峰值作用下，卵母细胞开始启动减数分裂，停滞在第二次减数分裂中期，此过程称为卵泡成熟；（3）静默状态的原始卵泡通过程序性凋亡、自噬、或其他未知途径死亡（Zhang 等，2015）；或者生长卵泡生长发育过程受阻发生闭锁、退化。猪出生后大约有 50 万左右原始卵图 1 猪卵泡发育时间进程表Fig. 1 The schedule of follicular development in pig
四川农业大学博士学位论文细胞着丝粒重复序列和两个 IGF2-H19 差异甲基化区域序列 DNA 甲基低。出生后，随着卵泡生长，卵母细胞基因组被重新甲基化（Reik 等，20随着卵母细胞体积增加,DNA 甲基化水平也增加，并在排卵前卵泡中达ng 等，2004）（图 2）。受精后，另一波去甲基化分别发生在父系（Oswald母系（Wang 等，2014）基因组。尽管 PGCs 上大量甲基化组信息被擦些基因组序列对表观遗传学擦除具有抗性（Guibert 等，2012）。因此甲基化状态是确定植入前胚胎甲基化状态非常重要的因素（Smallwoo
图 3 卵巢类固醇发生（椭圆中圈注的是每种固醇合成酶）Fig. 3 Ovarian steroidogenesis (The steroid synthetase are in the ellips化参与调控卵泡发生和类固醇生成关键基因括细胞增殖、分化和凋亡等过程，受到多种基因调控，、组蛋白甲基化和 miRNA 调控等）通过改变染色质结构调，2005）。目前研究发现 DNA 甲基化介导卵泡发生和类固卵泡生长和卵巢功能。13）给 21-24 日龄小鼠注射马绒毛膜促性腺激素刺激卵泡膜促性腺激素诱导排卵和黄体化。分别在注射人绒毛膜促 和 12h 收集卵巢颗粒细胞，检测 Star 和 Cyp19A1 变化，促性腺激素诱导 Star 启动区 H3K4me3 高甲基化，基化，进而增加 C/EBPβ 与 Star 启动区结合程度，上调 H3K4me3 低甲基化, H3K27me3 高甲基化，降低 CREB
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本文编号：
2809716
