猪基因组LncRNA基因内L1插入多态鉴定及其与生产性能关联分析

发布时间：2020-09-01 12:28

　　反转录转座子作为哺乳动物基因组主要组成部分,占哺乳动物基因组的30-45%,分为三大类:长散在的核元素(LINEs),短散在的核元素(SINEs)和长末端重复序列(LTR)。LIINE中的L1是哺乳动物基因组中含量最丰富的反转录转座子,占猪基因组的17.22%,小鼠的18.78%,人类的16.89%。由于它们的普遍分布,高拷贝数和大量插入多态性,L1被认为适合在哺乳动物中开发新的分子标记。同时研究表明反转录转座子是LncRNA序列的重要贡献者。超过三分之二的成熟LncRNA序列(分别为75%和68%的人和小鼠)在其序列中含有反转录转座子片段的插入。因此,本文尝试筛选鉴定猪LncRNA基因中L1的插入多态位点,并将插入多态与猪的生长性能进行关联分析,以开发新型有价值的转座子插入多态分子标记,同时探究了转座子插入对lncRNA调控靶基因的影响。结果如下:1.通过RepeatMasker获取了1553个猪LncRNA基因内的L1插入位点,并从丛因组中获取插入位点及两侧各800bp的序列,然后将每条序列在NCBI中与WGS库中的基因组测序数据进行在线Blast比对,并根据结果预测每个插入位点的多态性,筛选出266个L1疑似插入多态位点,然后设计PCR检测引物,并在杜洛克、长白猪、大白猪、二花脸、梅山猪、巴马香猪、藏猪、野猪8个品种进行验证。最后,我们获得了 114个插入多态位点。其中L1A多态位点28个,L1B多态位点6个,L1C多态位点14个,L1D多态位点66个。L1D的Blast判定多态位点数占LncRNA基因中L1D总位点数的39.52%,PCR验证有多态的占比对判定多态位点的81.44%,是L1中多态频率最高的一个家族。2.基于获得的114个L1插入多态位点,通过Blast鉴定L1与LncRNA之间的融合转录本,获得L1和LncRNA之间的融合转录本总共为40个,对应28个LncRNA基因。对这些融合转录本进行注释后发现,22(55%)个LncRNA完全由L1反转录转座子序列构成。3.通过RT-qPCR检测L1-LNC-276-F10位点对应lncRNA的靶基因ERA和ERAP2在7头具有不同插入情况的杜长大三元杂交猪的主要器官中的表达情况。结果表明,在脾脏组织中,ERAP1,ERAP2基因的表达量在纯合无插入(L1-/-)的个体中高于杂合(L1+/-)和纯合有插入(L1+/+)的个体。4.选择多态性位点L1-LNC-49和L1-LNC-253-F1,在大白猪群体(462头)进行插入多态性检测,并与其生产性能和繁殖性状进行关联性分析。结果显示,L1-LNC-49转座子无插入个体(L1-/-)的校正背膘厚显著大于有插入个体(L1-/+和L1+/+);L1-LNC-253-F1无插入个体(L1-/-)的同窝活仔数显著大于有插入的个体(L1-/+和L1+/+)。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S828
【部分图文】：

转座子,反转录转座子

发挥着重要作用：它们整合到新的基因组位点可改变相邻基因的表达水平或模式，或者它逡逑可以产生新基因，从而产生更大的遗传基因多样性［２］。几十年来的研宄结果表明：几乎所逡逑有的生物体内都有转座子的存在，但其含量存在较大的差异（如图１）。转座子是哺乳动物逡逑基因组的最大组分，生物信息学软件ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ的分析结果表明，转座子几乎占据了逡逑人类基因组的一半［３，４］。转座子在一些高等植物中所占比重更高，例如在玉米基因组中转座逡逑子占到８０％。因此，对基因组中转座成分的研究将会成为后基因组时代的研究热点和重要逡逑研究内容。逡逑娍，．逡逑图１．转座子在不同生物基因组中的分布逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎｓ邋ｉｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｇｅｎｏｍｅｓ逡逑１．２转座子分类逡逑转座子在结构和转座机制上都表现出广泛的多样性。首先，基于转座模式可以将转座逡逑子分成两大类：第一类称作反转录转座子（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ），简称“反座子”（ｒｅｔｒｏｐｏｓｏｎ）。逡逑反转录转座子又被称为ＲＮＡ转座子，先通过转录产生ＲＮＡ中间体，然后反转录成一个新逡逑的拷贝插入到新位置

电泳图,电泳图,电泳,品种

分子量ＤＬ邋２０００邋Ｍａｋｅｒ作为参照，连接电泳槽与电泳仪，用１３０Ｖ的剂的迁移位置，判断电泳情况，电泳结束后将凝胶置于盛有溴化乙锭色１０分钟，将凝胶拿出放到置于Ｔａｎｏｎ邋３５００全自动数码凝胶图像分记录。逡逑可用性筛选逡逑统计电泳结果，对电泳结果进行结果统计显示在８个品种猪中部分个判定为该引物在８品种猪难因组中该插入位点有多态；菜－引物在８测结果都无条带或都有阳性条带，则判定在８品种猪基因组中该插入的种群遗传关系鉴定以及关联性分析提供了依据。逡逑取质量与定量逡逑

转座子

通过ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ注解及与ＩｎｃＲＮＡ关联分析后获取了邋１５５３个猪ＬｎｃＲＮＡ基因内的逡逑Ｌ１插入位点及基因组序列，再通过ＮＣＢＩ数据库进行Ｂｌａｓｔ电子筛选然后进行ＰＣＲ实验验逡逑证。图４显示的是ＬＩ邋５ＨＪＴＲ及其侧翼区域序列在数据库中与多个猪基因组序列的比对结逡逑果，其右侧为转座子序列，左侧为它的侧翼序列。图４ａ，４ｂ，４ｃ表示，前几个基因组中有Ｌ１逡逑转座子位点插入，其余均显示没有找到含Ｌ１的５’ＵＴＲ序列，判定为疑似有多态；在图４ｄ逡逑的电子筛选图中，前面多个具有完整长度的条带表示在多个基因组中均有该Ｌ１的插入位逡逑点，判定疑似无多态。初步筛选疑似有多态的位点信息，以供后期设计引物进行实验验证。逡逑最终通过ＮＣＢＩ在线Ｂｌａｓｔ比对筛选出２６６个Ｌ１疑似插入多态位点，将所设计引物在逡逑杜洛克、长白猪、大白猪、二花脸、梅山猪、巴马香猪、藏猪、野猪８个品种，每个品种逡逑３个个体中进行多态检测实验。图５为部分标记在群体中有良好多态的电泳图结果。逡逑Ｌ邋ｌＤｌ－ｃｈｒｌ邋３：８０９２４１５８－８０９２５７１１（＋）逦ＨＡＬｌ－ｃｈｒｌｌ：９３２０９００－９３２２１９９（－）逡逑Ｉ逦３００逦６００逦９００邋ＵＯＯ邋ＩＳ００逦｛逦Ａｏ逦＇＇ｘ；逦ｒｓｓ逦ｌ邋Ａｄ逡逑

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