猪胸膜肺炎放线杆菌重组LOLA蛋白的免疫保护效果研究

发布时间：2020-09-01 19:42

　　猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoni,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种引起肺部为主要病变的致死性呼吸道疾病。其PCP的传播方式主要以猪群间通过高度接触性和呼吸途径传播,目前是世界养猪养猪业五大疾病之一。临床上其免疫预防以灭活苗进行,但存在抗菌谱窄,对肺部病变不能提供保护等缺点,所以有必要寻找新的候选疫苗。我们的前期研究发现,APP的LOLA是一种外膜蛋白,可能诱导有效的免疫保护作用,为了检测其免疫保护效果进行了本研究。根据GenBank中已报道的APP Lola基因序列设计引物对,以APP血清Ⅰ型基因组为模版,对APP Lola基因进行PCR扩增,送至生物公司测序后,对基因序列进行生物信息学分析。发现该基因Lola(GenBank登陆号为Bankit MH255942)由633bp组成,编码蛋白质含210个氨基酸,理论分子量为2 3458 Kd,等电点为9.70;分析得出蛋白Lola为一外膜脂蛋白,其三级结构为一网管状结构,包括疏水腔组成的一个闭合的β-桶和一个α螺旋盖结构,结构功能上具有保持外膜稳定,且该结构为膜提供通透性。同源性分析表明该基因的编码蛋白在不同的APP血清型之间同源性高,推测可以产生很好的交叉免疫保护效果。蛋白的N端前26个氨基酸为信号肽区。根据得到的APPLola核苷酸序列进行设计引物一对,对APPLola进行PCR扩增,下一步并亚克隆至pET32a(+)上,转化BL21(DE3)后,IPTG诱导重组菌表达,得到APP rLOLA蛋白。SDS-PAGE检测发现在23kD处出现特异性条带,West-blot检测发现重组菌表达的rLOLA能够被相应的阳性血清识别。将无菌小白鼠随机分为6组(公母随机),每组10只,A组为注射生理盐水组,B组为注射弗氏不完全佐剂组,A、B组均为实验对照组。C组注射低剂量rLOLA蛋白+佐剂剂量组,D组注射中剂量rLOLA蛋白+佐剂剂量组,E组注射中剂量rLOLA蛋白剂量组,F组注射为高剂量rLOLA蛋白+佐剂剂量组,C、D、E、F均为rLola免疫效果观察组。随后六组分别于第0、2、4周对小鼠进行相应的皮下注射,总计3次。并且在每次免疫前、以及小鼠攻毒前,总计通过尾部途径采血4次,用于测定其抗体滴度水平。在免疫周期完全结束的两周后,通过腹腔注射对各个实验小鼠进行APPⅠ型的攻毒感染,每只注射剂量为0.5ml每只,48h内观察并记录小鼠,鉴定免疫保护效果。结果表明,免疫效果观察组小鼠,可分别诱导免疫产生10%、20%、20%和40%存活率。实验对照组则全部死亡。存活的小鼠48h后临床状况逐渐好转并开始有采食行为。表明皮下注射rLOLA可以在小鼠体内诱导产生免疫应答和较高的抗体滴度水平。本研究为新型亚单位混合疫苗的疫苗成份提供了基础资料。
【学位单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

电泳图,电泳图,PCR扩增,基因

件对 Lola 蛋白进行结构和读框分析；使用 Pfam 在线.1server 软件分析 Lola 蛋白间结构；ExPASy 在线软件测质信号肽；使用 DNAMAN不同 APP 血清型的所有氨基增模板，进行目的基因 Lola胶成像系统中拍照，结果可合预期结果。

卷曲率,二级结构分析,蛋白,α-螺旋

图 2-3 进化树分析Fig.2-3 phylogenetic tree analysis of App Lola2.4 APP LOLA 蛋白的结构和功能分析使用 Sopma（https://npsa-prabi.ibcp.npsa_sopma）在线对 APP 的 LOLA 蛋白进行二级结构分析，所得结果如下：可见该蛋白：α-螺旋（alpha helix）：27.36%；β 片层(extendedstrand)：26.59%；β 转角(beta turn)：10.85%；无卷曲率(random coil)：34.91%（图 2-4）。

二级结构,蛋白质,蛋白

图 2-4 LOLA 的二级结构Fig.2-4 Secondary structure of App LOLA protein使用 TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)在线对 LA 蛋白质进行跨越膜区的预测。可见，App LOLA 蛋白有一膜结合区（图 2-5图 2-5 LOLA 跨膜区域分析Fig.2-5 Transmembrane structure of App LOLA protein

【参考文献】