非洲猪瘟病毒免疫抑制基因的筛选及RPA检测方法的初步建立

发布时间：2020-09-02 10:05

　　非洲猪瘟(Africa swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa swine fever virus,ASFV)引起家猪和野猪的一种急性、热性和高传染性的疾病。自1921年首次发现非洲猪瘟疫情,该病已在全球数十个国家流行。2018年8月1日,我国辽宁省沈阳市首次报道ASF疫情,经基因进化树分析发现该毒株属于基因II型,与Georgia 2007/1毒株属于一个进化分支。当前疫情已在河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林、天津、香港等32个省/直辖市/特别行政区蔓延流行,造成极大经济损失,我国生猪业也面临严峻考验。非洲猪瘟病毒基因组中约30%开放阅读框存在多个拷贝,即多基因家族(Multigene families,MGFs)。实验室前期研究表明,MGF360家族成员12L、13L、14L可能抑制IFN所介导的天然免疫应答,是基因缺失疫苗研制的主要靶标之一,因此针对抑制基因建立快速准确的检测方法非常重要。研究首先根据ASFV Georgia 2007/1分离株参考序列合成MGF360-12L、-13L、-14L基因,并克隆至pcDNA3.1真核载体,将重组质粒转染至PK15及293T细胞,通过荧光定量PCR检测基因对IFN-β(Interferon-β)表达的抑制作用,发现12L、13L的抑制作用较强。随后以pcDNA3.1-12L、-13L重组载体为模板,分别设计4组引物,选取特异性引物进行重组酶聚合酶(RPA)检测方法的初步建立。结果表明,所建立的12L基础RPA方法可在35℃、30 min时实现对目的片段的稳定扩增,而13L-RPA可在39℃恒温反应20 min完成扩增;该方法的敏感性可分别达到10~3和10~2个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增ASFV MGF360的12L或13L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2基因组没有扩增。使用ASFV基因组为阳性样品进行扩增发现,将基因组稀释后,12L-RPA、13L-RPA仍能检测到目的基因的存在,表明该检测方法具有一定的临床价值。分别选择pGEX6p-1、pET-21a、pET-28a、pET-32a大肠杆菌原核表达载体进行免疫抑制蛋白12L和13L的表达。表达条件经优化后,表达产物均为包涵体形式,实验发现以pET-21a为载体表达的包涵体蛋白溶解效果最好,纯化后的蛋白浓度可达200-500μg/mL。综上,研究基于ASFV MGF360-12L、-13L基因序列,初步建立了RPA检测方法,可对病毒MGF360-12L、-13L基因实现快速、特异性扩增,为后续12L、13L基因缺失疫苗的鉴别诊断提供一定的技术支持。同时克隆表达并成功纯化12L、13L蛋白,为后续多克隆抗体的制备、间接ELISA检测方法的建立及相关蛋白的功能研究进行了前期储备。
【学位单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

病毒结构,蛋白

SF 的新发地和再发地，蜱虫带毒后，病毒在其体内的感染能除，同一疫源地再次发病可能性仍存在，例如葡萄牙有一个发 ASF，其原因在于带毒蜱虫的存在（Boinas FS et al.,2011）污染物等间接传播迅速扩散，如果未能经妥善处理病猪的分是很危险的传染源（Sanchez-Vizcaino J M et al.,2012）。在需求量极大，但饲养卫生及生猪贸易生物安全措施的有所欠缺一；其四是野猪-栖息地的循环传播，主要包括患病与未患病与被污染的栖息地之间的间接传播（中国兽医协会等，2018毒结构及分类膜包被，内含线性双链 DNA，病毒呈现复杂的二十面体结构毒基因组大小约为 170-190 kb，共编码 160-175 个开放阅读框毒颗粒包含 50 多种蛋白质，其中主要包括结构蛋白、早期转ejo Aet al.,2018）。病毒组成的关键蛋白参见图 1.1。

原理图,原理,变温过程,核酸扩增

图 1.2 RPA 扩增反应原理Fig.1.2 RPAamplification reaction principle常见核酸扩增方法的比较的核酸检测方法主要有普通 PCR、荧光定量 PCR、巢式 PCR、CPA、LA法与 RPA 之间的比较。表 1.2 常见核酸检测方法的比较Table1.2 Comparison of common nucleic acid detection methods板类型引物数量酶的种类是否需要预变性反应温度（℃）反应时间（min）DNA 2 1 是经过变温过程 60-180 DNA 2 1 是经过变温过程 60-180 DNA 4 1 是经过变温过程 120-180 DNA 5-6 1 否 57-63 60 DNA 4-6 1 否 60-65 60-90 NA，2-3 3 否 25-42 15-30

产物分析,基因扩增,紫外

表 2.9 荧光定量 PCR 反应体系Table 2.9 RT-qPCR reaction system反应组分体积（μL）e PCR Super Mix 10ward Primer 0.8verse Primer 0.8cDNA 2变性 1 min；95 ℃变性 15 s、60 ℃退火 1线。实验得到的数据进行差异性分析，可初基因片段的扩增琼脂糖凝胶电泳，如图 2.1 所示，紫外下发现大小与预期相符。

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