鸡卷羽性状候选基因KRT75和KRT75L4的表达特征分析

发布时间：2020-09-02 21:07

　　羽毛作为一种直观、易于观察且表现丰富的外观性状,一直是人们研究的热点。国外学者研究显示KRT75基因cds区69 bp的缺失是导致鸡卷羽性状发生的主要原因,但在本课题组早期研究发现我国地方品种麒麟鸡的KRT75基因与正常羽的的完全相同,不存在缺失。同时我们通过一代测序检测发现KRT75L4基因cds区存在15 bp(chr:33:1295046-1295060)缺失。这表明我国地方鸡种与国外鸡种卷羽形成的机制不同。为了进一步证实我国地方鸡种麒麟鸡卷羽形成的原因,本研究以麒麟鸡和怀乡鸡为研究对象,针对卷羽性状的候选基因KRT75L4和KRT75基因展开了较为深入的研究,旨在探索调控麒麟鸡卷羽性状发生的主要基因。本研究采集不同品种且无血缘关系的麒麟鸡104只,片羽鸡95只和杂交F1代半卷羽86只,对麒麟鸡的KRT75L4基因进行检验,并采用生物信息学的方式法预测其功能;对胚胎期和出生后麒麟鸡、怀乡鸡的KRT75L4和KRT75基因的时序表达规律和在皮肤和肝脏中的时空表达情况进行了研究;通过Western Blot对麒麟鸡和怀乡鸡的KRT75蛋白的时序表达规律并采用免疫荧光技术检测KRT75蛋白表达的具体位置。结果发现:(1)所有麒麟鸡的KRT75L4基因均存在缺失,而在F1代则出现缺失和未缺失的杂带,说明KRT75L4基因的缺失是卷羽麒麟鸡所特有的,并且可以遗传给下一代;通过生物信息学预测KRT75L4蛋白是一个亲水,无信号肽,无跨膜区的蛋白,虽然其碱基的改变导致其二级结构有少许变化,但是其三级结构并未发生改变。(2)胚胎期麒麟鸡和怀乡鸡的KRT75L4基因在皮肤组织都是呈先升后降的表达趋势,所不同的是麒麟鸡在14胚龄达到最高值,而怀乡鸡则在11胚龄达到最高值;胚胎期KRT75基因在怀乡鸡中是上升趋势,在17胚龄达到最高峰,而麒麟鸡则是先升后将的趋势,在11胚龄达到最高峰;出生后的麒麟鸡和怀乡鸡的KRT75L4和KRT75都是上升的趋势。(3)KRT75蛋白在胚胎期麒麟鸡的表达是呈上升趋势,而怀乡鸡的却恰恰相反,是一种下降的趋势,KRT75蛋白在上皮细胞中特异性表达,而且多表达在毛囊的羽小板、轴板和缘板的区域,极少表达在髓质区域。综上所述,卷羽麒麟鸡与片羽怀乡鸡的KRT75L4基因在DNA序列上有区别,卷羽麒麟鸡KRT75L4基因cds区存在15 bp(chr:33:1295046-1295060)缺失,而怀乡鸡没有缺失。该基因在片羽鸡中表达量达到峰值的时间早于卷羽鸡。KRT75基因序列在两个鸡种中无区别,但是表达量有区别。因此,KRT75L4基因突变引起卷羽性状形成的分子机制有待深入研究。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S831.2
【部分图文】：

鸡公,母鸡

新石器时期对于畜禽的驯养就已经开始了，最初它们主要用作玩赏、供。几千年来，由于地理环境的差异和复杂多样性的生态条件，不同区域以及不一样不同的生活习惯，在长达数千年的的自然选择和人工选择过了家禽资源多样性，并培育出许多各具特色且品质优良的地方品种[1-2进化过程中由于家禽的基因突变、染色体变异等原因导致了各种表型变，如玫瑰冠、双重冠、豆冠、丝羽、卷羽、冠毛、耳毛、胡须、裸颈、]。文所研究的麒麟鸡是我国广东粤西一带的地方特有的家禽品种，因其全向身体外翻卷而得名，又称为翻毛鸡、卷羽鸡（见图 1-1）。在高温高下，麒麟鸡生长迅速，体型偏大，抗病力强，耐热性能好，耐粗饲，肉当地人认为麒麟鸡具有可治疗胃病、风湿杂症等病的功效，因此麒麟鸡人们喜爱[4-5]。其独特的羽毛外翻的性状与片羽（正常羽）形成显著差性状研究的理想素材，同时为地方品种遗传资源的保护与开发提供条

角蛋白,系统发生树,人类

它们都是在上皮细胞中独特表达。角蛋白由 54 个保守基因(28 个 I 型，26 个 II 型)编码(图1-2)，并以成对的形式对组织类型、分化等进行调控。角蛋白作用于多种稳态和应力触发的机械和非机械功能，包括维护细胞的完整性，调节细胞的生长和迁移，以及防止细胞凋亡等。这些生理过程都受到翻译后角蛋白和其相关蛋白的严格调控。角蛋白编码序列的的突变是细胞穿透性改变和罕见疾病发生的基础，其病理生理学反映了角蛋白的突变会导致细胞脆性或组织稳态改变。此外，角蛋白突变或失调是急、慢性疾病的重要因素因素。角蛋白(Mr:40-70 kDa)是所有上皮细胞中纤维细蛋白的主要亚型，已知 54 个保守的功能基因和蛋白，约占哺乳动物角蛋白超家族的四分之三[6]。随着人类和小鼠基因组的测序的完成，在 2006 年重新设计了一种新的命名法，为了适应更多新角蛋白基因的被发现鉴定[7,8]。针对 I 型和 II 型角蛋白从基因序列、分子结构以及蛋白质序列α-螺旋同源性等方面进行区分。由于 I 型角蛋白的总电荷显示为酸性(pI 4.5-6.0)且分子量往往较小(40-56.5 kDa)，而 II 型角蛋白的总电荷一般为中性或者为碱性(pI 6.5-8.5)且分子量较大(50-70 kDa)[9]，我们可以通过二维凝胶电泳很容易将它们区分出来。I 型和 II 型角蛋白在装配成 10 纳米长丝时是严格相互依赖的

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鸡卷羽性状候选基因 KRT75 和 KRT75L4 的表达特征分析是髓质和羽枝嵴的形成等方面，因此推测 KRT75 基因在表皮的羽和羽小枝分化的过程发挥作用[24]。由于国外针对卷羽的研究采用为茅斯洛克卷羽鸡作为实验对象，这种鸡出雏时绒羽正常，没有表现而麒麟鸡的的仔鸡初生时绒羽弯曲明显（图 1-4）。这种表现的差由国、内外品种差异还是其他遗传变异所致，但是我们可以确定麒状的不是 KRT75 基因突变导致的，因此引起麒麟鸡卷羽性状发生鉴定及其分子机制还需要我们更深入的研究。

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