重组LAP-CATHL2抗菌肽体外表达及其奶牛乳房炎的防治

发布时间：2020-09-02 20:19

　　奶牛乳房炎是奶牛养殖业中最常见的、最高发的和能引起严重损失的奶牛疾病之一。奶牛乳房炎不仅能降低奶牛的奶产量和牛奶的品质,还能引起严重的食品安全问题。早期对乳房炎的防治,主要是使用抗生素。但是,因为滥用和长期使用抗生素,在治疗奶牛乳房炎的同时,也出现了一些其他的重要问题,如细菌产生了对抗生素的耐药性,影响治疗效果和牛奶中有过多的抗生素的残留而引起的食品安全问题等。目前,在奶牛乳房炎的治疗上,非抗生素物质的使用越来越多,而非抗生素物质也逐渐已成为治疗奶牛乳房炎的主要药物,其治疗策略也逐步替代以前的抗生素治疗。抗菌肽(Antibacterial peptide,ABP),是生物体内普遍存在的一类具有强烈抗菌作用的小分子多肽,在机体抵抗病原入侵方面起着重要作用。抗菌肽因其独特的抗菌机制和广谱、高效的抗菌活性而引起普遍关注。目前,运用基因工程方法表达抗菌肽基因,用于畜牧业中以防治家禽和家畜的某些疾病是抗菌肽应用的热点,也是治疗奶牛乳房炎的安全有效的手段之一。本研究通过重叠延伸PCR克隆了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽,构建了它的原核、酵母和奶牛乳腺细胞3种表达载体,表达并纯化了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽,并检测了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的抗菌谱及最小抑菌浓度,分析了它的序列结构特性。此外,本研究还通过构建奶牛乳房炎动物模型,检测了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽对奶牛乳房炎的防治效果。本研究首先从牛舌鳞状上皮细胞和股骨骨髓细胞中分别克隆出牛β-防御素LAP和牛CATHL2抗菌肽,然后利用重叠延伸PCR克隆得到重组牛LAP-CATHL2抗菌肽。本研究将重组牛LAP-CATHL2抗菌肽分别克隆进pGEX-4T-1载体、pPICZαA载体、和插入了αS1酪蛋白调控序列作为启动子的pCMV-C-Flag载体,分别构建了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的原核表达载体、酵母表达载体和奶牛乳腺细胞表达载体,并将这些表达载体分别转进感受态大肠杆菌BL21、毕赤酵母GS115和分离纯化的原代奶牛乳腺细胞中。对这些表达系统中的重组牛LAP-CATHL2抗菌肽进行诱导表达,并纯化得到了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽。其产量分别是2.83、1.16、0.114 mg/mL培养液。用包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌在内的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、致病性大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、无乳链球菌(S.agalactiae)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes NICPBP54002)、克雷伯氏菌(Klebsiella spp.)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC10987)和白色念珠菌(Nostoc)等9种菌对重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的抗菌谱进行分析。结果表明,重组牛LAP-CATHL2抗菌肽具有广泛的抗菌谱,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均有明显的抑菌效果,在9种测试菌中尤其对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、无乳链球菌和白色念珠菌的抑菌能力最强。用金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、无乳链球菌和白色念珠菌检测了3个不同表达系统表达的重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的最低抑菌浓度。结果表明,原核表达系统表达的此抗菌肽活性最低,其对4种测试菌的最小抑菌浓度依次是500μg/mL、250μg/mL、250μg/mL和500μg/mL;酵母表达载体表达的抗菌肽对4种测试菌的最低抑菌浓度分别是125μg/mL、62.5μg/mL、62.5μg/mL和125μg/mL;奶牛乳腺上皮细胞表达载体表达的抗菌肽对4种测试菌的最低抑菌浓度分别是31.25μg/mL、31.25μg/mL、31.25μg/mL和62.5μg/mL。用生物信息学软件和网站预测分析了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽的亲/疏水性、跨膜区域、信号肽结构、磷酸化位点、氨基酸序列一级结构、二级结构和三级结构等结构信息。结果表明,重组牛LAP-CATHL2抗菌肽既有亲水性部分也有疏水性部分,属于两亲性蛋白。此外,其序列中有明显的跨膜区域和多个可能的磷酸化位点;在二级和三级结构中,此抗菌肽的二级结构主要包含β-折叠,有多个正向或反向的β-折叠区域,各个β-折叠区域以其两端的松散的成环状的肽链连接。利用致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌感染,构建了奶牛乳房炎的动物模型。通过乳房灌注试验和乳房注射质粒试验检测了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽对奶牛乳房炎的防治效果。结果表明,乳房灌注时,当抗菌肽浓度为250 mg/mL,每个乳区每天灌注10 mL抗菌肽溶液时,酵母和奶牛乳腺细胞表达系统表达的重组牛LAP-CATHL2抗菌肽对奶牛乳房炎均有很好的治疗效果,而原核系统表达的抗菌肽治疗效果不明显;乳房注射质粒时,注射奶牛乳腺细胞表达系统的质粒对奶牛乳房炎有很好的预防效果,而注射原核和酵母表达系统的质粒时,其预防效果不明显。本试验成功克隆了重组牛LAP-CATHL2抗菌肽,并构建了其原核、酵母和奶牛乳腺细胞3种表达质粒。在3种表达系统中均成功诱导表达了具有广谱抗菌活性的重组牛LAP-CATHL2抗菌肽,原核表达系统中表达的重组抗菌肽活性最低。此外,奶牛临床试验表明,酵母和奶牛乳腺细胞两种系统体外表达的重组抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的奶牛乳房炎有显著治疗效果,而在乳腺注射质粒时,只有奶牛乳腺细胞表达载体对奶牛乳房炎有显著防治效果。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

分析图,载体,测序,分析图

-防御素 LAP 的克隆。M：DL 2000 的 DNA Marker；1-3：分别用原核表达系统细胞表达系统的特异性 LAP 引物进行 PCR 扩增的牛β-防御素 LAP 条带。B：切验证。M：DL 5000 的 DNA Marker；1-3：pMD-18-LAP 载体用 EcoR I 单酶切；4-6 I 和 Sal I（4 和 6）或 Kpn I（5）双酶切。ing of bovine beta-defensin LAP. M: DNA Marker (DL 2000), 1-3: bovine beta-defenPCR used the specific LAP primers of prokaryotic expression system, yeast expressnd cell expression system; B:The verification of pMD-18-LAP vector by single and ker (DL 5000), 1-3: The pMD-18-LAP vector was enzymed by EcoR I, 4-6: The pMD by EcoR I and Sal I (4 and 6) or Kpn I (5).图 3-2 牛 β-防御素 LAP 的克隆及 pMD-18-LAP 载体单、双酶切验证loning of bovine beta-defensin LAP and verification of pMD-18-LAP vectand double enzyme成功的阳性载体进行测序。将测序结果在 NCBI 网页上进行 blast 分析 3-3 中，测序结果与牛 β-防御素 LAP（Bos taurus lingual antimicrobial pquence ID: NM_203435.4）的序列 100%符合，结果说明，我们成功扩P，且无序列突变。选择无突变的载体转化到 TOP10 感受态大肠杆菌，提质粒备用。

分析结果图,测序,载体,牛骨

结果与分析将连接成功的阳性载体进行测序。将测序结果在 NCBI 网页上进行 blast 分析，其结果见图 3-5。在图 3-5 中，测序结果与牛骨髓 Cathelicidin 类抗菌肽 CATHL2（Bos taurus cathelicid2 (CATHL2), mRNA，NCBI Reference Sequence: NM_174826.3）的序列 100%符合，结果说明我们成功扩增出了牛骨髓 Cathelicidin 类抗菌肽 CATHL2，且无序列突变。选择无突变的载体转化到 TOP10 感受态大肠杆菌中，LB 培养基摇菌扩增，提质粒备用。

序列,抗菌肽,表达载体,长度

其结果见图 3-11。在图3-11 中，EcoR I 单酶切的样品在的在约 4350 bp（pPICZα A 表达载体的长度约为 3600 bp，重组牛 LAP-CATHL2 抗菌肽序列的长度 750 bp，两者之和约为 4350 bp）处有条带，而 EcoR I和 Kpn I 双酶切的样品在约 3600 bp（pPICZα A 表达载体的长度）和约 750 bp（重组牛LAP-CATHL2 抗菌肽序列长度）处均有条带，这个结果说明，重组牛 LAP-CATHL2 抗菌肽序列被成功的连结到 pPICZα A 表达载体上。阳性载体标记为 pPICZα A-LAP-CATHL2 载体。将验证阳性的菌液用 LB 培养基摇菌扩增，用质粒提取试剂盒提质粒，-20℃保存备用。

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