寨卡病毒VLP疫苗的研制及埃博拉病毒快检方法的建立

发布时间：2020-09-05 07:54

　　 寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)是由伊蚊传播的黄病毒属病毒,孕妇感染寨卡病毒后,可造成新生儿小头症。已有研究证实ZIKV感染为格林巴利综合征的病因之一;由于与我国接壤的越南等国爆发了 ZIKV疫情,因此我国面临潜在的输入性风险。由于病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)与病毒粒子结构相似,而且不含病毒遗传物质,具有强免疫原性,能诱导机体产生高滴度抗体,是最为安全有效的疫苗研发策略。本研究选择毕赤酵母表达系统表达重组ZIKV囊膜蛋白(Env),纯化重组蛋白后,体外组装VLP,动物实验评价了 VLP疫苗免疫保护效力。目的:本研究以ZIKV囊膜蛋白(Env)为研究对象,通过毕赤酵母表达系统获得重组ZIKV囊膜蛋白,体外组装成VLP,通过小鼠感染模型,进行免疫保护实验,验证VLP疫苗侯选株保护力,为开发以VLP为基础,安全高效的ZKIV疫苗奠定前期研发基础。方法:(1)构建重组表达质粒,利用毕赤酵母表达系统表达ZIKV囊膜蛋白,通过不同浓度zeocin抗生素,筛选高拷贝菌株。(2)诱导表达并纯化目的蛋白,首先采用镍离子金属鳌合层析柱对重组目的蛋白进行初步纯化,然后通过分子筛层析进一步的纯化,通过免疫印迹(Western Blot)和质谱检验目的蛋白是否成功表达。(3)根据不同离子强度和pH值的VLP组装缓冲液,筛选出VLP体外组装的最优条件,通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定VLP组装效果。(4)将获得的高纯度ZIKVVLP免疫小鼠,酶联免疫吸附测定(ELISA)和细胞中和实验检测小鼠体内诱导的抗体滴度变化,确认其体液免疫水平,酶联免疫斑点检测(ELISPOT)检测记忆性淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4细胞因子;胞内细胞因子染色,鉴定记忆性CD8+T和CD4+T细胞分泌INF-γ和IL-4能力,评价其细胞免疫水平,建立小鼠感染模型,攻毒实验验证ZIKV VLP疫苗侯选株对小鼠的保护力。结果:(1)构建了重组表达质粒,经测序验证表明重组质粒构建正确。(2)通过Western Blot和蛋白质谱检测,证明了 ZIKVEnv获得成功表达。(3)通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定组装效果,证明了组装后的VLP呈球状,与天然ZIKV粒子大小基本一致,ZIKVVLP体外组装成功。(4)蚀斑减少中和试验(PRNT)证明了 ZIKV VLP能够诱导生成高滴度的中和抗体,ELISPOT和胞内细胞因子染色分析,证明了可诱导机体产生强细胞免疫反应。(5)小鼠动物攻毒保护实验,证明了 ZIKVVLP能够使免疫缺陷小鼠(A129)获得致死剂量病毒攻击的完全保护。结论:利用毕赤酵母表达系统成功表达ZIKVEnv,并在体外成功组装了 VLP,免疫小鼠能实现完全保护,本研究获得的ZIKVVLP疫苗侯选株有望开发为一种安全高效的ZIKV疫苗。另外,还研究了可在15 min内检测埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)快速检测技术,将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫,以1 mg/mL的EBOV-VP40单克隆抗体(McAb,4B7F9)和羊抗兔IgG,按2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异的检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(EBOV-VLP)和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒(MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8(IAV/PR/8)、黄热病毒(YFV-17D)、登革热病毒2型(DEN2)无交叉反应,显示良好的特异性。本研究建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。
【学位单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S859.797
【部分图文】：

埃博拉病毒（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）是丝状病毒属，有包膜不分段的负链ＲＮＡ病毒。埃博拉逡逑毒颗粒有三种基本形态形式：空的，链接的和连续的。直径约８０邋ｎｍ，最常见的病毒逡逑粒类型长度为９８２±７９ｎｍ。埃博拉病毒基因组由七个非分节基因组成，其编码核蛋白逡逑ＮＰ），病毒颗粒蛋白（ＶＰ３５，邋ＶＰ４０）邋［７５］，糖蛋白（ＧＰ），ＶＰ３０，邋ＶＰ２４［７６］和邋ＲＮＡ邋依赖逡逑ＲＮＡ聚合酶（Ｌ）。除ＧＰ基因外，所有埃博拉病毒基因各自编码一个结构蛋白，编逡逑分泌的ＧＰ蛋白作为ＧＰ基因的主要产物，分泌型ＧＰ具有干扰宿主免疫反应的能力。逡逑有两个域，包括ＧＰ１和ＧＰ２，邋ＧＰ１含有受体结合域，而ＧＰ２含有融合蛋白和跨膜结逡逑。ＧＰ独特的跨膜表面蛋白介导病毒与受体结合后进入宿主细胞。ＶＰ２４是另一种相逡逑结构蛋白，埃博拉病毒ＲＮＡ基因组被核蛋白包裹形成核糖核蛋白复合物。该核蛋逡逑ＶＰ３５，邋ＶＰ３０和ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶缔合，形成功能性转录酶复合物，ＶＰ３５［７７］逡逑作为干扰素拮抗剂。核衣壳蛋白由ＶＰ２４，邋ＶＰ３０，邋ＮＰ和ＶＰ３５组成，ＶＰ２４和ＶＰ３逡逑核蛋白壳周围的桥梁。逡逑＊＊逡逑

（１）称量０．０１邋ｇＢＳＡ，溶于ｌＯｍＬＰＢＳ中，制成ｌ．Ｏｍｇ／ｍＬＢＳＡ；逡逑（２）用ＰＢＳ将邋１＿０邋ｍｇ／ｍＬ邋ＢＳＡ稀释成０．２邋ｍｇ／ｍＬ、０．４邋ｍｇ／ｍＬ、０．６邋ｍｇ／ｍＬ、０．８邋ｍｇ／ｍＬ的逡逑ＢＳＡ；逡逑（３）在微孔板中分别加入１０卟梯度稀释的ＢＳＡ，然后加入待测样品１０邋ｐＬ，邋ＢＳＡ和待逡逑测样品都做２复孔，最后每孔板中加入２００邋ｐＬ邋ｌｘ邋Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ浓缩液；逡逑（４）将微孔板在酶标仪Ａ５９５ｎｍ波长下读值，制作标准曲线并计算待测样品的浓度。逡逑３实验结果逡逑３．１高抗性重组菌株的筛选逡逑将ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（ＡＴＭ）、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（Ａｓｔｅｒｎ）三个重组质逡逑粒分别ｓａｃｌ酶切线性化后，电转化Ｘ３３酵母感受态细胞，涂ｌｍｇ／ｍｌ的ｚｅｃｏｉｎＹＰＤＳ平板上逡逑筛选高拷贝菌株，３０邋°Ｃ温箱孵育７２邋ｈ，长出单克隆重组毕赤酵母菌，如图（ｆｉｇ邋２－１）。逡逑

寨卡病毒ＶＬＰ疫苗的研究及埃博拉病毒组质粒菌液ＰＣＲ及测序鉴定逡逑物对分别对Ｚｅｏｃｉｎ？抗性平板筛选出的酵增出约１３７０邋ｂｐ的片段，均与理论大小相／ＰｒＭ／Ｅ邋（ＡＴＭ）、ｐＰＩＣＺＡ／ＰｒＭ／Ｅ邋（Ａｓｔｅｒｎ）ｂｐ邋Ｍ邋１邋２邋３邋４邋５邋６逡逑

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本文编号：2812759