奶牛乳腺炎差异表达基因筛选及miR-146a在乳腺上皮细胞炎症反应中的功能研究

发布时间：2020-09-05 11:49

　　奶牛乳腺炎是奶牛场最常见疾病之一,严重影响着奶牛场的经济效益。为培育乳腺炎抗病性强的奶牛品种,乳腺炎相关基因挖掘及分子调控机制研究显得尤为重要。乳腺炎奶牛的基因表达谱受病原菌的类型、感染剂量、感染时间等因素的影响比较大。迄今为止,奶牛乳腺炎的分子机制尚未完全清楚。因此,为深入、系统地挖掘乳腺炎相关基因,探讨奶牛乳腺炎的分子机制,本研究分别利用E.coli或S.aureus,采用与文献报道不同的感染剂量(5mL 1×10~5 CFU/mL)和感染时间(7d),成功构建了E.coli型和S.aureus型的实验性乳腺炎模型,在此基础上,分别进行了乳腺组织和诱导不同时间外周血的转录组、miRNA组测序和差异表达mRNA、miRNA筛选,并进行了乳腺组织mRNA-miRNA联合分析。此外,采用miRNA超表达/沉默、qPCR、Western Blotting、ELISA、流式细胞等技术,进行了差异表达bta-miR-146a在LPS诱导的乳腺上皮细胞(bMEC)炎症反应中的分子机制研究,获得了如下主要结果:(1)E.coli和S.aureus感染的两种类型乳腺炎奶牛乳腺组织中TLR4/NF-κB信号通路关键分子TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB和TNFα的表达量均显著升高(P0.01),说明该模型启动了固有免疫应答和炎症反应。(2)获得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺组织的mRNA和miRNA表达谱,以及差异表达mRNA(DIE-mRNA)和差异表达miRNA(DIE-miRNA)。与对照组相比,E.coli诱导组乳腺组织中有2388个DIE-mRNA和305个DIE-miRNA;S.aureus诱导组乳腺组织中有2642个DIE-mRNA和279个DIE-miRNA。其中,LOC785756、AQP5、bta-miR-202和bta-miR-2357可能为E.coli型乳腺炎乳腺组织的分子标志物;DDC、C1QTNF3、CCDC60、TCTEX1D1、ZNF358、FNDC1、COL11A1和bta-miR-2335可能为S.aureus型乳腺炎乳腺组织的分子标志物。(3)E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺组织的基因表达谱差异很大。与S.aureus诱导组相比,有627个DIE-mRNA和21个DIE-miRNA在E.coli诱导组乳腺组织中表达显著下调(P0.001);482个DIE-mRNA和70个DIE-miRNA在E.coli诱导组乳腺组织中表达显著上调(P0.001),推测这些DIE-mRNA和DIE-miRNA在两种类型乳腺炎症反应过程中的作用可能存在差异,也可能与炎症程度和免疫应答过程不同步有关。(4)获得了乳腺炎乳腺组织在免疫调节和细胞凋亡方面的miRNA-mRNA调控网络。在免疫调节方面,miRNA主要调节TLRs信号通路、CD家族、细胞因子或细胞因子受体相关的mRNA。在细胞凋亡方面,两种类型乳腺炎存在共同调控的4个mRNA(BAX、BCL2A1、BCL2L14和PYCARD)和5个miRNA(bta-miR-1486、bta-miR-885、bta-miR-30e-5p、bta-miR-139和bta-miR-1291)。(5)获得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎奶牛不同诱导时间外周血的基因表达谱和差异表达基因。其中,6个已知基因(ZBTB39、AMER1、KLHL9、ABHD13、FZD5和TET2)和3个新基因(Cow_newGene_1702、Cow_newGene_4598和Cow_newGene_4025)可能为E.coli型乳腺炎的血液分子标志物;HBM、HBG、DEFB5、CCR3、bta-miR-1301和bta-miR-2284r可能为S.aureus型乳腺炎的血液分子标志物。(6)获得了E.coli型和S.aureus型乳腺炎乳腺组织和外周血的DIE-miRNA和DIE-mRNA的功能注释。结果表明所获得的DIE-miRNA和DIE-mRNA与遗传信息处理、生物系统、疾病、代谢、细胞过程和环境信息处理6个方面有关,并共同参与了包括TLRs信号通路、趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体作用信号通路、白细胞跨内皮迁移等在内的多个关键免疫信号通路,进而调节奶牛乳腺炎的发展过程。(7)TLR4和TRAF6为bta-miR-146a的靶基因。在LPS诱导bMEC炎症反应的过程中,bta-miR-146a可靶向抑制TRAF6基因的mRNA和蛋白质表达;对于TLR4基因而言,在细胞炎症反应前期,bta-miR-146a可显著抑制TLR4基因的表达(P0.05),而在炎症反应后期,bta-miR-146a的抑制效应差异不显著(P0.05),表明在炎症反应后期可能有其他因子共同调节着TLR4基因的表达。(8)LPS可激活bMEC内TLR4/NF-κB信号通路,使得TLR4、TRAF6和转录因子NF-κB的表达量升高,从而促使bta-miR-146a的表达量升高,而高表达的bta-miR-146a负反馈抑制靶基因TLR4和TRAF6的表达,进而抑制了NF-κB的表达和炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,缓解了bMEC的炎症反应过程。(9)bta-miR-146a促进了炎症反应过程中bMEC的凋亡。上述研究为阐明奶牛乳腺炎的分子机制奠定了基础,为乳腺炎的基因诊断、基因治疗和抗病分子育种提供了新思路,具有潜在的应用价值。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

信号转导通路,结构域,宿主细胞

则由 TIR（Toll/IL-1 receptor）结构域构成(Akira et al. 2006; Kum)。TLRs 蛋白的 LRR 结构域可以识别宿主细胞外的 PAMPs，），而胞内的 TIR 结构域可与 MyD88 的 C 端 TIR 结构域结MyD88 再通过 N 端的 DD 结构域与下游信号分子 IL-1R 相关RAKs 磷酸化后可活化 TRAF6，激活 JNK 和 NF-κB 信号通路和 NF-κB 的表达，从而使炎症因子、黏附分子等多种炎症相引起宿主细胞固有免疫反应（图 1-1）(Akira et al. 2001; WerlingLRs 研究进展和小鼠 TLRs 在免疫系统中的作用机制研究的深入开展，牛开。迄今为止，发现牛 TLRs 家族至少有 10 个成员，其中定位在 BTA6 上，TLR7 和 TLR 定位在 X 染色体上，TLR2、LR9 分别定位在 BTA17、BTA27、BTA8、BTA16 和 BTA22 上(Mc. 2003)。qPCR 研究结果显示，TLR1~10 在牛机体防御有关的zies and Ingham 2006)。

乳腺组织,乳腺炎,腺泡

表明乳腺炎模型已成功建立。2.3.2 乳腺组织病理鉴定为了确认临床检查结果，本研究通过乳腺组织切片的 H＆E 染色和病理观察，来验证乳腺炎的病理情况，结果如图 2-1 所示。结果表明，与对照组（图 2-1A）相比，E.coli感染组（图 2-1B）和 S.aureus 感染组（图 2-1C）产生了明显的病理变化，如：乳腺小叶结构破坏，有些乳腺上皮细胞产生分离，腺泡腔减小，乳腺腺泡受损，并出现炎性细胞（包括中性粒细胞和巨噬细胞）浸润等。上述结果表明，我们成功诱导了奶牛乳腺炎，可用于后续的高通量测序和基因/蛋白质表达量检测。A B C

信号通路,乳腺组织,免疫荧光,内参

并进行了比较分析，结果如图2-2、图 2-3、图 2-4、图 2-5 和图 2-6 所示。结果表明，与对照组相比，S.aureus 诱导组和 E.coli 诱导组的 TLR4、IRAK1、TRAF6、NF-κB 和 TNFα 蛋白质的表达量显著上升（P<0.01），表明 S.aureus 和 E.coli 分别使得奶牛乳腺组织启动了 TLR4/NF-κB 信号通路介导的固有免疫和炎症反应过程。此外，S.aureus 诱导组乳腺组织中 TLR4、IRAK1 和TRAF6 蛋白质的表达量显著高于 E.coli 诱导组（P<0.01），而两个实验组间 NF-κB 和 TNFα的表达量差异均不显著（P>0.05），表明 S.aureus 对 TLR4/NF-κB 信号通路上游基因表达量的影响较大。为了验证免疫荧光的可靠性，我们对信号通路关键的 TLR4、TRAF6 和 NF-κB 蛋白质进行了 Wertern Blotting 检测，并以 β-actin 为内参

【参考文献】