TLRs介导的天然免疫应答在贾第虫致病中的作用及机制

发布时间：2020-09-08 16:32

　　十二指肠贾第虫(Giardia duodenalis),也称蓝氏贾第虫(Giardia lamblia),简称贾第虫(Giardia),是一种重要的寄生性人兽共患原虫,由其引起的贾第虫病被称为“旅行者腹泻”,临床上表现为腹痛、腹泻、呕吐以及婴幼儿发育迟缓等症状,并可引起胆囊炎及肝脏损坏,严重时可导致婴幼儿和免疫缺陷患者的死亡。美国已将贾第虫列入生物恐怖的黑名单,世界范围内城市供水和生活饮用水卫生标准均把贾第虫检测作为必检指标之一。目前临床上常用甲硝唑治疗贾第虫病,而甲硝唑对孕妇和哺乳期的女性毒副作用很大。迄今尚无理想防治贾第虫的办法,究其原因就是对贾第虫的致病机制缺乏详尽的了解,尚未找到药物或疫苗关键靶位。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是参与机体先天免疫的一类重要模式识别受体,能够识别病原微生物的保守结构成分,激活机体的先天免疫应答。TLRs能够识别多种病原寄生虫,如弓形虫、隐孢子虫、疟原虫及锥虫等,并发挥重要的抗感染作用。目前为止,关于贾第虫激活宿主TLRs的研究较少,TLRs在贾第虫病致病过程中的作用和机制尚未阐明。本研究将通过对贾第虫病毒对贾第虫形态、生长发育的影响及其分子基础进行分析,对TLRs介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制进行研究,以期阐明宿主抗贾第虫天然免疫应答作用机制,为贾第虫病的防治提供理论基础。TLR2受体介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制。通过荧光定量方法检测贾第虫对宿主巨噬细胞TLR2的激活,结果表明贾第虫能够激活TLR2;通过Western blot和ELISA方法分别检测贾第虫对宿主巨噬细胞信号通路的激活及细胞因子的分泌,结果表明,贾第虫能够依赖于TLR2激活P38、ERK和AKT信号通路,并且通过TLR2-AKT信号通路显著抑制TNF-α、IL-12p40、IL-6的分泌;通过动物试验研究TLR2在贾第虫感染过程中的作用,结果表明,贾第虫感染宿主后能够通过激活TLR2-AKT信号通路抑制IL-12 p40等细胞因子的分泌,使小鼠肠道内滋养体增加,肠道病变加重,导致更为严重的贾第虫病。TLR3受体介导天然免疫应答在贾第虫致病过程中的作用及机制。首先,我们用贾第虫病毒感染无病毒株贾第虫构建了新的VIG虫株。通过荧光定量方法检测不同虫株贾第虫对宿主巨噬细胞TLR3的激活,结果表明TLR3能够识别携病毒株和VIG株而不能识别无病毒株,进一步分析表明TLR3能识别前两者中的贾第虫病毒ds RNA;通过ELISA方法检测不同虫株贾第虫对宿主巨噬细胞信号通路的激活及细胞因子的分泌,结果表明,携病毒株和VIG株通过激活TLR3信号通路引起的细胞因子分泌显著多于无病毒株,进一步分析表明,贾第虫病毒ds RNA也通过激活TLR3信号通路引起的细胞因子分泌;通过动物试验研究TLR3在不同虫株贾第虫感染过程中的作用,结果表明,携病毒株和VIG株贾第虫相对于无病毒株贾第虫,感染宿主后能够通过激活TLR3信号通路提高TNF-α、IL-6及IL-12 p40的分泌,使小鼠肠道内滋养体减少,肠道病变减轻,导致较轻的贾第虫病。贾第虫病毒对贾第虫形态、生长发育的影响及其分子基础。通过扫描电镜和透射电镜对病毒感染后滋养体形态及超微结构观察,结果表明,病毒感染无病毒滋养体出现尾部结节,结节内包含糖原和病毒样粒子。通过对不同虫株滋养体增殖和体外诱导成囊率进行统计分析,结果表明,携病毒株和VIG株滋养体相对于无病毒株增殖更快,而诱导成囊率更低。通过RNA-seq方法对VIG株和无病毒株贾第虫进行转录组测序分析,结果发现,贾第虫病毒感染后能够通过调控贾第虫滋养体糖代谢信号通路影响贾第虫的增殖和成囊。综上所述,本研究发现贾第虫能够激活宿主TLR2-AKT信号通路,抑制促炎性细胞因子的分泌,导致野生型小鼠较严重的贾第虫病。携病毒株和VIG株激活TLR3信号通路,增加促炎性细胞因子的分泌,引起野生型小鼠较轻的贾第虫病。进一步研究表明TLR3识别的分子是贾第虫病毒ds RNA,而且贾第虫病毒能够通过糖代谢通路影响贾第虫生长发育。以上结果显示贾第虫通过激活宿主TLR2逃避免疫攻击,通过激活宿主TLR3发挥抗贾第虫感染作用,从而揭示了贾第虫致病的新机制。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.4
【部分图文】：

流程图,文库构建,流程

图 3.1 文库构建流程Fig 1.1 The construction process of the library数据的生物信息学分析据预处理以去除低质量区域和衔接子序列。使用 TopH 贾第虫转录组进行比对（ A 型， WB 株，b.org/Giardiadb/;（38,39））。 HTSeq 计数统计出每个基 R 包中的 edgeR 对差异表达基因（DEG）进行鉴定（标准化为每百万个读数（RPM）在不同样品之间进行，并且仅保留至少两个样品中具有至少 1RPM 表达水。将具有以下标准的基因设定为显着 DEGs 的阈值：株的贾第虫的基因显示至少两倍的表达改变，校正的 p（倍数变化）| > 1。随后，使用 GOseq R 软件包基于富集分析，校正的 p 值阈值设置为 0.05。生物信息学

流程图,生物信息学分析,流程

图 1.2 生物信息学分析流程Fig 1.2 Bioinformatics analysis process1.2.15 差异基因荧光定量验证为了验证 RNA-seq 分析得到的差异基因结果，我们使用与 RNA 测序相同的 RNA 样品反转录后，随机挑选了（GL50803_101589），葡萄糖-6-磷酸 N-乙酰转移酶（GL50803_14259），VSP（GL50803_115742），组织蛋白酶 L 前体（GL50803_9548），NADP 特异性谷氨酸脱氢酶（GL50803_21942），假定 RNA解旋酶（GL50803_6616），ATP 依赖性 RNA 解旋酶样蛋白（GL50803_15048），假定蛋白（GL50803_17354），核仁蛋白 NOP2（GL50803_16948）和鞭毛相关蛋白（GL50803_41512）等 10 个 RNA-Seq 数据进行 qRT-PCR 分析验证。所有用于qRT-PCR的引物均使用Primer 6软件设计并由Sangon Biotech（中国上海）合成。所有荧光定量使用的引物如下：

滋养体,贾第虫,无病毒,病毒株

图 1.3 贾第虫滋养体A,B,C 分别代表贾第虫携病毒株、无病毒株以及 VIG 株滋养体Fig 1.3 Giardia trophozoites,C represents GLV-containing、GLV-free、VIG(GLV-infected Giardia) Giardstrain, respectively 携病毒、无病毒以及 VIG 株贾第虫滋养体总 RNA 提取验证将提取的各虫株滋养体总 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳，以验证虫株的准确发现，无病毒株贾第虫滋养体总 RNA 只有 3 条核糖体 RNA 带，而携病新构建的 VIG（即 GLV-infected Giardia）虫株均含有 4 条带，且二者最带均为 6.3kb 左右，与已报道的贾第虫病毒条带大小吻合，得到的 VIG 稳定携带贾第虫病毒。RNA 在 260/280 的吸收值比在 1.80-2.00 之间，说的总 RNA 质量良好，可进行后续实验。结果见图 1.4。15000M 1 2 3

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