氯化镍致雏鸡肾脏损伤的机理研究

发布时间：2020-09-08 14:28

　　镍(Ni)广泛存于自然界,因其具有良好的物理和化学特性,常被用于化学工业。镍和镍化合物的广泛分布和应用增加了人和动植物接触的可能性。由于工业三废处理的不完善和不彻底,废旧电池等环境污染处理不恰当,导致环境中的镍污染物日益增加。镍已被确定为是一种具有毒性和致癌性的重金属。研究发现过量的镍能诱导氧化应激、炎症反应、细胞凋亡及坏死等,进而损伤组织器官的结构和功能。肾脏是镍主要的储存和排泄器官,也是镍攻击的靶器官之一。氯化镍(NiCl_2)是自然界中最常见的镍化合物,也是人和动物最常接触的镍毒性物质。目前,尚未见有NiCl_2致人和动物肾脏损伤及其作用机制的系统研究报道。本研究应用实验病理学、生物化学、免疫组织化学、TUNEL、ELISA、流式细胞术、qRT-PCR等方法,研究日粮NiCl_2对雏鸡肾脏损伤的影响,包括肾脏组织结构与功能损伤、氧化损伤、细胞周期改变、内质网应激、细胞凋亡以及炎症反应,在组织、细胞和分子水平上探讨NiCl_2致肾脏损伤的作用机理,为基础研究和生产实践提供理论依据。研究内容和研究结果如下:1.NiCl_2对雏鸡肾脏结构、功能和氧化损伤的影响试验选用1日龄艾维因肉鸡健雏280只,随机分为4组,每组70只,分别饲以对照日粮和实验日粮(NiCl_2 300 mg/kg、600 mg/kg和900 mg/kg)42天。试验期间,每天进行临床观察。试验第14、28和42天,肾脏病理学观察结果表明,日粮NiCl_2 300mg/kg及其以上引起肾脏脏器指数降低、肾小管上皮细胞颗粒变性、空泡变性、坏死和凋亡,肾脏组织结构受损。上述变化呈现时间和剂量依赖性。试验14、28和42天,肾脏功能指标的生化检测结果显示,NiCl_2 300mg/kg及其以上时,Na~+/K~+-ATP酶活性、Ca~(2+)-ATP酶活性、LDH酶活性、SDH酶活性和ACP酶活性降低,ALP酶活性升高,肾脏功能降低,与肾脏组织结构受损一致。同时发现肾脏Ni含量与肾脏结构、功能受损程度成正比。试验的14、28和42天,应用生物化学和qRT-PCR法检测了肾脏氧化损伤指标、非酶性和酶性抗氧化指标。结果发现,NiCl_2 300mg/kg及其以上引起NO、MDA、8-OHdG含量升高,GSH含量和羟自由基抑制能力下降,抗氧化酶(CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、GST、GSH-Px和GR)和总抗氧化(T-AOC)活性降低,以及抗氧化酶(CuZn-SOD、Mn-SOD、CAT、GST、GSH-Px、GR)mRNA表达水平降低,iNOS酶活性和mRNA表达量水平升高,肾脏发生氧化损伤,也是NiCl_2致肾脏结构和功能损伤的病理基础。2.NiCl_2对雏鸡肾脏细胞周期的影响试验动物的分组及管理与1同。试验的14、28和42天,流式细胞术检测结果显示,NiCl_2300mg/kg及其以上显著增加肾脏G_2/M期细胞的百分率,降低G_0/G_1期细胞的百分率,对S期无显著影响,肾脏细胞周期受抑于G_2/M期。应用qRT-PCR和免疫组化方法测定了细胞G_2/M期的调节因子,发现抑制G_2/M期的途径是ATM介导的p53依赖途径和非p53依赖途径,p-ATM的蛋白表达和ATM mRNA表达水平显著升高。在p53依赖途径中,p53和p21的蛋白表达和mRNA表达水平显著升高。在非p53依赖途径中,p-Chk1和p-Chk2的蛋白表达和Chk1和Chk2的mRNA表达水平显著升高,p-cdc25C的蛋白表达和cdc25mRNA表达水平显著降低。同时,调节细胞周期G_2到M期的cdc2、cyclinB和PCNA的蛋白表达和mRNA表达水平也显著降低。结果表明,NiCl_2通过ATM-p53-p21和ATM-Chk1/Chk2-cdc25通路抑制肾脏细胞周期的G_2/M期,肾脏细胞的增殖和肾脏的生长发育受阻。3.NiCl_2对雏鸡肾脏细胞内质网应激的影响试验动物的分组及管理与1同。试验的14、28和42天,qRT-PCR和免疫组化检测结果发现,NiCl_2 300mg/kg及其以上时肾脏内质网应激标志蛋白GRP78和GRP94的蛋白表达和mRNA表达水平显著升高,肾脏细胞发生内质网应激。应用qRT-PCR方法检测了内质网应激中未折叠蛋白反应(UPR)。结果表明,NiCl_2300mg/kg及其以上时,UPR中的3个经典分支通路被激活:(1)胰腺内质网激酶(PERK)通路:在PERK通路中真核翻译起始因子2a(eIF2?)、活化转录因子4(ATF4)的mRNA表达显著升高;(2)需肌醇跨膜激酶/核酸内切酶1(IRE1)通路:在IRE1通路中IRE1、XBP1的mRNA表达显著升高;(3)活化转录因子6(ATF6)通路:在ATF6通路中ATF6的mRNA表达显著升高。4.NiCl_2对雏鸡肾脏细胞凋亡的影响试验动物的分组及管理与1同。试验的14、28和42天,流式细胞术和TUNEL法检测结果发现,NiCl_2 300mg/kg及其以上时肾脏细胞的凋亡率明显增高,并由线粒体介导的凋亡通路、死亡受体Fas介导的凋亡通路和PI3K/Akt抗凋亡通路所诱导。试验的14、28和42天,qRT-PCR和免疫组化测定结果显示,调节线粒体膜稳定性的Bcl-2家族蛋白失衡,其中抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的蛋白表达和mRNA表达水平显著降低,促凋亡蛋白Bax、Bak的蛋白表达和mRNA表达水平显著升高。流式细胞术和qRT-PCR检测结果显示,线粒体膜电位(MMP)受损,促凋亡蛋白cyt c、AIF、Smac、EndoG、HtrA2、Apaf1、caspase-9、caspase-3、caspase-6、caspase-7、PARP的mRNA表达水平显著升高,抗凋亡蛋白XIAP的mRNA表达水平显著降低。免疫组化染色结果也发现,cyt c、caspase-9、c-caspase-3、c-PARP的蛋白表达水平显著升高。上述结果表明,NiCl_2 300mg/kg及其以上时,肾脏细胞线粒体介导的凋亡通路被激活。试验的14、28和42天,qRT-PCR和免疫组化测定结果表明,NiCl_2 300mg/kg及其以上引起肾脏Fas、FasL、caspase-8、caspase10、Bid的mRNA表达水平显著升高,c-caspase-8和caspase-10的蛋白表达水平显著升高,肾脏细胞死亡受体Fas介导的凋亡通路被激活。试验的14、28和42天,qRT-PCR检测发现NiCl_2 300mg/kg及其以上时,肾脏PI3K、Akt1和Akt2的mRNA表达水平显著降低,肾脏细胞PI3K/Akt抗凋亡通路受抑。5.NiCl_2对雏鸡肾脏细胞炎症反应的影响试验动物的分组及管理与1同。试验的14、28和42天,qRT-PCR和免疫组化检测结果发现,NiCl_2300mg/kg及其以上显著提高肾脏核转录因子NF-κB mRNA表达和p-NF-κB的蛋白表达水平,炎症因子TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-18的mRNA表达水平也显著升高,激活了NF-κB信号通路,引发肾脏发生炎症反应。同时,qRT-PCR检测结果发现,NiCl_2 300mg/kg及其以上可抑制肾脏抗炎症因子IL-2、IL-4、IL-13的mRNA表达水平,促进肾脏炎症反应的发生。上述结果表明,日粮NiCl_2 300 mg/kg及其以上引发肾脏组织结构损伤、功能损伤、氧化损伤、细胞周期阻滞、内质网应激、细胞凋亡和炎症反应。氧化损伤是NiCl_2致肾脏损伤的病理基础,而细胞周期阻滞、内质网应激、细胞凋亡和炎症反应则是NiCl_2致肾脏损伤的作用途径。本文首次系统地研究了NiCl_2对雏鸡肾脏结构、功能和氧化损伤、细胞周期、内质网应激、细胞凋亡和炎症反应的影响,并从细胞水平、基因水平和蛋白水平上探讨了分子机理。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S859.8
【部分图文】：

模式图,细胞周期,模式图

与细胞周期胞周期（cell cycle）是指连续分裂的细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次有束所经历的整个过程称为一个周期。细胞周期主要包括 G0 期（静息期）、G1 合成前期）、S 期（DNA 合成期）、G2 期（DNA 合成后期）和 M 期（有丝分 1-1）。正常的细胞周期对于维护器官和组织的发育有很重要的作用，当细胞停滞时，组织中细胞增殖和死亡细胞的平衡被打破，组织器官就会发育不良甚]。而当细胞周期过快时就会引发细胞的过度增殖，继而引起组织器官的肥大甚细胞周期是一个受严格控制的的进程。细胞出现紧急情况时，如当中心粒或动能，染色体断裂，DNA 损伤等，细胞周期检测点会立即停止细胞周期的进程，止于细胞周期的某一特定时期内，对其损伤进行修复，若修复无效则使细胞发。

未折叠蛋白,跨膜蛋白,磷酸化,内质网

录因子6（ATF6）。正常生理状态下，内质网内3种跨膜蛋白都与葡萄糖调节蛋白（GRP78）等伴侣分子结合而处于无活性状态。ERS发生后，3种跨膜蛋白都将从GRP78等伴侣结合蛋白上解离出来，活化PERK、IRE1及ATF6启动相应的基因转录（图1-2）[58, 90]。（1）PERK通路：PERK是内质网Ⅰ型跨膜蛋白，属于丝/苏蛋白激酶，与GRP78解离后，通过寡聚化并自我磷酸化而激活，活化的PERK磷酸化eIF2α，从而广泛下调了

细胞凋亡,进程,细胞

9. 镍与细胞凋亡9.1 细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）一词首先是由 Kerr 等（1972）于 1972 年提出，是指细一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，通过激活 DNA 内切酶，使细胞核发缩，裂解，最后形成凋亡小体，被有吞噬能力的细胞清除（图 1-3）[103]。细胞凋亡体生长发育的正常现象，对于维持多细胞机体的完整性、免疫系统的调节和自身稳有重要作用。当细胞凋亡受到抑制，细胞逃脱了细胞轮回的循环，就会导致细胞无殖而引起肿瘤发生。相反，当细胞凋亡无限制性的发生时就会引起细胞过度损伤和而导致神经退行性疾病如帕金森病（Parkinson）和阿尔兹海默症（Alzheimer）[104胞的凋亡与抗凋亡处于一种动态平衡状态。

【参考文献】