宠物大肠杆菌、耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法的建立及初步应用

发布时间：2020-09-08 12:31

　　当前,我国宠物数量逐年增多,随之而来的宠物疫病也不断增加,由此造成了公共卫生问题不容乐观。宠物大肠杆菌病、耶尔森菌病、空肠弯曲菌病等是目前比较常见的人兽共患细菌性传染病,临床症状主要是严重的腹泻。目前针对这3种宠物细菌性疾病的检测方法虽然对该病的诊断起到了重要作用,但普遍存在检测耗时长,步骤繁琐,假阳性率偏高等问题,这与快速检测方法“实时”、“快速”的要求相距甚远。因此,建立一种快速检测方法对于这3种细菌性疾病的监测防控具有重要意义。荧光偏振检测法(Fluorescence Polarization Immunoassay Assay,FPIA)属于均相的免疫分析方法,具有简单、可靠、快速和高效的特点,可满足高通量、高速度、多残留和自动化的检测要求。本研究以荧光素FITC标记产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌的特异性蛋白,并以标记产物为示踪物建立一种新型荧光偏振免疫技术,从而达到简单灵敏且快速的检测效果。主要研究内容和结果如下:1、对产肠毒素大肠杆菌FaeG基因、小肠结肠炎耶尔森菌ail基因和空肠弯曲菌Peb1A基因进行原核表达,对重组蛋白进行鉴定,证明蛋白具有良好的免疫原性。2、利用荧光素FITC在碱性条件下能与蛋白的胺基发生结合的特点,将FITC蛋白偶联形成示踪物FITC-FaeG、FITC-ail、FITC-Peb1A,通过荧光光谱鉴定及琼脂糖凝胶电泳对所形成的示踪物进行鉴定。3、人工感染新西兰大白兔制备产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌及空肠弯曲菌全菌多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,分别为1:64000、1:128000和1:102400。4、对示踪物最佳反应时间、最佳反应浓度及血清最佳稀释度进行优化后,建立产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法,并对本方法各项指标进行评估,结果显示:(1)产肠毒素大肠杆菌荧光偏振抗体检测方法的最低检测效价为1:80,仅与产肠毒素大肠杆菌阳性血清发生特异性反应,但在其他阳性抗血清中无交叉反应,具有高度的特异性;批内批间变异系数为0.43%~3.47%和1.35%~4.68%,变异范围均小于10%,重复性较好。(2)小肠结肠炎耶尔森菌荧光偏振抗体检测方法最低检测效价为1:120,具有较强的特异性;批内批间变异系数为0.69%~3.81%和2.52%~6.47%,变异范围均小于10%,具有较好的重复性。(3)空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法最低检测效价为1:160,具有较强的特异性;批内批间变异系数为0.69%~3.81%和2.52%~6.47%,变异范围均小于10%,具有较好的重复性。5、本研究建立的三种抗体检测方法和相应的市售ELISA试剂盒同时对200份犬的临床血清样本进行检测,结果产肠毒素大肠杆菌总体符合率为95%;小肠结肠炎耶尔森菌总体符合率为93%;空肠弯曲菌总体符合率为89%。综上所述,本研究通过对产肠毒素大肠杆菌FaeG基因、小肠结肠炎耶尔森菌ail基因和空肠弯曲菌Peb1A基因的原核表达,以及FITC对其进行标记形成示踪物,建立了产肠毒素大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌和空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法。本研究建立的方法具有较好的特异性、灵敏度及重复性,达到简单、灵敏且快速的检测效果,可应用于血清中抗体的快速检测,为宠物3种细菌性疾病的流行病学调查和监测提供技术和产品。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

荧光偏振,检测原理

图 4-1 荧光偏振检测原理Fig.4-1 Principle of fluorescence polarization detection光偏振检测的优点和缺点具有与 ELISA 等其他免疫分析方法的相同特点外，FPA 还具有以：. 均相系统，不需要洗涤操作，可大大减少试剂的用量；. 检测速度很快，且易于自动化，适于快速的筛选检测；. 荧光标记抗原的均一性好，性质稳定，可长期保存，方法的重现. FP 值是一个比值，与其他荧光检测技术相比，不易受溶液颜色和化的影响，结果稳定，可靠性高；. 选用不同发射波长的荧光素来进行多标记检测，可实现多目标物定量分析。

基因,PCR扩增,基因组,测序

图 1-1 FaeG 基因 PCR 扩增结果1 the result of FaeG gene PCR amplificA 分子量标准（DL2000）；1-2 FaeG 基因 PCR Marker (DL2000); 1-2 FaeG gene PCR pr隆森菌基因组为模板扩增 ail 基因，得到测序发现分别与 GenBank 中 ail 基因序

基因,PCR扩增,基因组,测序

图 1-1 FaeG 基因 PCR 扩增结果-1 the result of FaeG gene PCR amplifA 分子量标准（DL2000）；1-2 FaeG 基因 PA Marker (DL2000); 1-2 FaeG gene PCR 隆森菌基因组为模板扩增 ail 基因，得测序发现分别与 GenBank 中 ail 基因序。

【参考文献】