NP蛋白与宿主互作调控新城疫病毒复制的机制研究

发布时间：2020-09-08 08:42

　　新城疫(Newcastle Disease,ND)是一种急性、烈性呼吸道传染病,是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引发的禽类疫病,严重威胁了养禽业的发展,已被世界动物卫生组织列为必须通报的疫病。NDV是具有囊膜包裹的单股负链RNA病毒,其基因组能编码六个结构蛋白和两个非结构蛋白。其中,核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)是NDV基因组中表达量最多的结构蛋白。NP蛋白与磷蛋白(phosphate protein,P)、大分子聚合酶蛋白(large protein,L)和病毒核酸共同形成病毒复制的基本单元,核糖核蛋白复合体(ribonucleoprotein complex;RNP)。NP蛋白还具备影响病毒毒力、介导细胞免疫应答和引发自噬等功能。这些信息表明NP是一个多功能蛋白。然而,目前关于NP蛋白是通过哪些宿主蛋白发挥作用的尚无相关报道,为了揭示NP蛋白发挥相关功能的分子机制,本文主要从以下四个方面展开研究:(1)为了验证NP蛋白对NDV复制的影响,构建了NP的真核表达载体,并验证其能在DF-1细胞中正常表达。然后在DF-1细胞中过表达NP蛋白,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中过表达NP蛋白能够促进病毒复制。为进一步研究NP蛋白促进病毒复制的机制,通过Q-PCR检测干扰素IFNα、IFNβ、IFNγ的表达量,表明NP蛋白能抑制干扰素的表达。这些结果说明NDV的NP蛋白可能通过拮抗干扰素,从而促进病毒复制。(2)为了探究NP蛋白与哪些宿主因子互作调控病毒的复制,将NP基因克隆至pGBKT7载体上,经过自激活验证和毒性检测合格后,以pGBKT7-NP为诱饵筛选鸡胚成纤维细胞cDNA酵母文库,最终获得包含PIAS4(Protein inhibitor of activated STAT4)和PSMA7(Proteasome subunit alpha type 7)等共20个与NP蛋白相关的宿主蛋白。(3)为了探索PIAS4与NP蛋白的关系,在DF-1细胞中过表达NP蛋白,通过Q-PCR检测发现NP蛋白可抑制内源性PIAS4的表达。然后在DF-1细胞中分别过表达PIAS4和用siRNA敲低内源性PIAS4,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中PIAS4能够抑制病毒复制。为进一步研究PIAS4发挥抗病毒功能的机制,通过VSV感染实验和Q-PCR检测过表达PIAS4后细胞上清或细胞中干扰素的含量,发现PIAS4可能通过促进干扰素的表达从而抑制病毒复制。(4)为了验证PSMA7的作用,构建了PSMA7的真核表达载体,并验证其能在DF-1细胞中正常表达。然后,在DF-1细胞中分别过表达PSMA7和用siRNA敲低内源性PSMA7,通过Q-PCR、蚀斑和Western blot的方法检测病毒含量,结果表明在DF-1细胞中PSMA7能够抑制病毒复制,而且在DF-1细胞中过表达NP蛋白会抑制内源性PSMA7的表达量。然而通过VSV感染实验和Q-PCR检测干扰素含量的结果表明PSMA7不通过干扰素信号通路发挥抗病毒功能。综上所述,NDV的NP蛋白能通过与PIAS4和PSMA7这两个宿主蛋白互作,并下调这两个蛋白的表达,促进病毒的复制。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

新城疫病毒,结构示意图,分类学,病毒复制

物学特征 RNA 病毒，在分类学上属于副粘病毒科）(Cox et al. 2017)。目前关于 NDV 基因nt 和 15198nt(Alíz Czeglédi et al. 2006；Lurthy et al. 1998；Buchholz et al. 1999)。NP-P-M-F-HN-L-Trailer-5’），共编码 6 个protein, NP）、融合蛋白（fusion protein, 蛋白（ matrix protein, M ）、血凝素aminidase protein, HN）、大分子聚合酶蛋其中，P 基因转录时会发生编辑，分别在码突变，分别编码出V和W两个非结构蛋株都满足“六碱基原则”，即当病毒复制时毒完成高效复制(Calain et al. 1993)。

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图 1-2 酵母双杂交系统检测蛋白互作的原理(段强德 2009Figure 1-2 Detection of protein interactions by yeast two hybrid sy杂交技术在 NDV 中的研究概况技术在研究病毒与宿主之间的关系方面，具有重大意义研究中，已经有许多利用酵母双杂交技术的报道。在宿以 NDV M 蛋白为诱饵，利用该技术筛选得到与 NDV 次揭示了 M 蛋白的入核机制(Duan et al. 2018)。还有研 11 种副粘病毒 V 蛋白 C 端能与 MDA-5 互作，这为副基础(Childs et al. 2007)。胡湘云以 NDV F 蛋白为诱饵库，得到了能和 F 蛋白产生特异性反应的纳米抗体(胡抗 HN 的纳米抗体，得到了有抑制病毒复制作用的纳构建了鸡胚成纤维细胞 cDNA 酵母文库(褚志礼 2018)，酵母双杂交技术筛选该文库，得到了与 V 蛋白互作的能的研究，其中 TXNL1 和 CacyBP 能通过促进细胞凋亡l. 2018；Chu et al. 2018)。

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图 2-1 NP 真核表达载体的构建A，扩增得到 1470 bp 的 NP 基因；B，菌液 PCR 验证；C，酶切验证构建的质粒Figure 2-1 Construction of NP eukaryotic expression plasmide 1470 bp NP gene was obtained by RT-PCR amplification; B, Results of PCR based on tranbacteria; C, The identification of plasmid digested with EcoRI and XholI.2 NP 真核表达载体的表达将构建成功的 pCAGEN-Flag-NP 质粒转染至 DF-1 细胞，24 h 后收取蛋白样 Western blot 检测 NP 蛋白的表达情况（图 2-2），结果表明 NP 蛋白能在 DF-常表达。图 2-2 NP 蛋白在 DF-1 细胞中的表达Figure 2-2 Detection of NP protein expression in DF-1 cells

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