牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-09-08 08:36

　　牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染牛表现出一种复杂,多种临床表现的疾病,主要为腹泻、急性及慢性黏膜病、先天性缺陷、免疫抑制、免疫耐受、持续性感染、母畜流产,死胎和畸形胎等[1],该传染病严重影响了世界养牛业的发展。随着规模化养殖和种畜的频繁调运,该病在我国流行趋势也逐渐上升,给养牛业带来了巨大的经济损失[2]。本研究利用从内蒙古周边某些牧场采集的鼻拭子样本和血液样本,样本经处理后,分别接种已长成单层的MDBK细胞培养瓶,用已设计好的引物PCR鉴定为阳性后分离出牛病毒性腹泻病毒,利用纯化后的病毒进行后续的试验。首先我们分析了牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)E2蛋白的主要编码区,利用PCR扩增技术将BVDV-1 E2基因定向克隆到表达载体Pcold-TF上,将Pcold-TF-E2转化至感受态细胞BL21中,使用IPTG进行重组蛋白的诱导表达,诱导表达的条件为0.8 mMol/L IPTG 37℃诱导4 h。收集菌液,经过超声破碎裂解后,利用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达的重组蛋白E2鉴定大小为82 Kda,与预期条带相符。使用裂解表达、纯化后的产物E2蛋白,作为包被抗原,建立了用于检测牛病毒性腹泻病毒的间接ELISA方法。确定反应的最佳条件为:抗原包被浓度为8 ug/mL,最佳包被温度和时间为4℃ 16 h,一抗血清稀释比为1:100,反应温度和时间为37℃1 h,最佳封闭液为10%PEG4000,37℃封闭1 h,酶标二抗的稀释度为1:6000,反应温度和时间为37℃1h。通过试验确定阴阳判定的临界值为0.33。该方法与牛传染性鼻气管炎、牛传染性胸膜肺炎、赤羽病、副结核、布鲁菌病,小反刍兽疫等阳性血清均无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性,将BVDV的阳性血清稀释至1:4096时仍可判断为阳性,表明所建立的方法具有较高的敏感性,组间和组内重复试验变异系数均小于5%,表明该方法具有较好的重复性。采用以上建立的间接ELISA方法和通过IDEXX BVDV抗体检测试剂盒检测189份血清临床样品,两者的符合率为92.8%。由以上结果可知,本试验建立的间接ELISA方法可以为该病的快速诊断,以及流行病学调查等提供便捷有力的手段,且价格成本低廉。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.23
【部分图文】：

细胞病变,细胞,病毒

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间接免疫荧光试验

逦内蒙古农业大学硕士学位论文逦１３＿逡逑２．邋３．邋４间接免疫灭光试验结果邋？逡逑Ａ为未接种病毒的间接免疫荧光图，Ｂ为细胞接种的未稀释过的ＢＶＤＶ病毒液间接逡逑免疫荧光结果图，Ｃ为用ＤＭＥＭ以１：１０稀释的病毒液接种细胞的间接免疫荧光试验结逡逑果，Ｄ为１：１００稀释的病毒液接种细胞的间接免疫荧光试验结果，Ｅ为１：邋２００稀释的逡逑病毒液接种细胞的间接免疫荧光试验结果。逡逑

预期结果,引物,基因,片段

图６邋ＰＣＲ扩增结果逡逑

【参考文献】