表面展示鹅干扰素α新功能型乳酸菌的构建及抗小鹅瘟病毒效果研究

发布时间：2020-09-08 20:49

　　 小鹅瘟是一种高发病率和高死亡率的传染病,给我国养鹅业造成了巨大危害。目前小鹅瘟病尚无有效的治疗药物,主要依靠卵黄抗体(Immunoglobulin of yolk,IgY)和高免血清等进行防治,所以新型药物的研制具有重要意义。干扰素(IFN)是体内一种重要的干扰病毒繁殖的免疫活性细胞因子,主要由病毒、噬菌体及人工合成核苷酸(如聚肌胞)诱生,具有广谱的抗病毒活性,对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用,还具有抗增殖,抗肿瘤和免疫调节细胞反应的功能。本研究将鹅干扰素α(goIFNα)克隆至大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP409-pgsA’中,并将其电转化至植物乳杆菌NC8中获得具有抗病毒效果的新功能型乳酸菌,本研究对制备抗病毒新型微生态制剂防治小鹅瘟病以及确保动物的生产安全与食品安全具有重要意义。具体研究方案与结果如下:根据大肠杆菌偏爱密码子对GenBank上已发表的鹅IFNα序列基因进行优化,通过生物公司合成后,将goIFNα片段与原核表达载体pET28-a连接,成功构建了原核表达质粒pET28-a-goIFNα,并将质粒转入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经过IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot检测。SDS-PAGE和Western-blot的鉴定结果表明,goIFNα蛋白分子量大小在18kd左右,与预期大小相同,同时具有良好的反应原性。通过切胶回收的方法将目的条带回收,将蛋白胶碾碎后与PBS混合后,将其打入小鼠体内,15天后回收血清。Western-blot的鉴定结果表明成功制作鼠抗goIFNα血清。根据GenBank上已公布的鹅IFNα序列在其完整的开放阅读框上下游设计上、下游引物,并分别在上游引物和下游引物中加入XbaⅠ和HindⅢ酶切位点。以质粒pMD18-T-goIFNα为模板PCR扩增,获得goIFNα基因片段并与大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pSIP409-pgsA’连接,构建穿梭表达质粒pSIP409-pgsA’-goIFNα。经电转化至植物乳杆菌NC8中,构建新功能型乳酸菌NC8-pSIP409-pgsA’-goIFNα(以下缩写为pp-goIFNα/NC8)。提质粒后进行PCR、双酶切验证,并将质粒测序。验证结果均证明成功构建新功能型乳酸菌。新功能型乳酸菌经清酒乳杆菌素sakasin-P(SppIP)诱导后超声破碎和反复冻融,经Western-blot分析,结果表明新功能型乳酸菌已表达goIFNα蛋白,通过免疫荧光试验也证明了goIFNα锚定表达在菌体表面具有良好的反应原性。通过鹅胚成纤维细胞(GEF)对新功能型乳酸菌的抗病毒效果进行体外检测。首先测定不同浓度(10:1、80:1、160:1)的新功能型乳酸菌的抗病毒效果,新功能型乳酸菌与细胞之间浓度比为80:1时抗病毒效果最佳。随后将新功能型乳酸菌以80:1的比例孵育细胞,设置DMEM空白对照,GPV对照,干扰素蛋白对照,NC8空载体(NC8pSIP409-pgsA’,pp/NC8)组,pp-goIFNα/NC8+GPV组(即先加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8后加入小鹅瘟病毒GPV),GPV+pp-goIFNα/NC8组(即先加入小鹅瘟病毒GPV后加入新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8)。结果显示,与空载体组相比,pp-goIFNα/NC8+GPV组、GPV+pp-goIFNα/NC8组以及蛋白组均有良好的抗病毒作用。除此之外我们还测定了细胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干扰素刺激因子MX、OAS和PKR基因的相对表达量,结果显示,与空载体组相比,pp-goIFNα/NC8+GPV组、GPV+pp-goIFNα/NC8组以及蛋白均能够上调GEF的goIFNα和goIFN-β基因表达水平,由此上调细胞内干扰素刺激基因(ISG)的mRNA水平,保护细胞不受小鹅瘟病毒的感染。将新功能型乳酸菌在3日龄雏鹅连续口服3天,第4天对雏鹅攻毒,同时记录体重,计算体重变化率和生存情况。免疫结束后取组织进行相关指标的检测。取血清测定抗病毒因子IFNα和IFN-β在外周血中的水平,取脾脏检测组织中细胞抗病毒因子goIFNα和goIFN-β以及干扰素刺激因子MX、OAS和PKR基因的基因表达量。取肝脏、心脏、脾脏和肠道制作病理切片观察组织病理学变化。结果显示,攻毒后Normal组、GPV组、pp/NC8+GPV组、pp-goIFNα/NC8+GPV组、GPV+pp-goIFNα/NC8组以及IgY组雏鹅的存活率分别为100%,30%,40%,50%,70%和40%。提取脾脏中病毒DNA和总RNA后检测,结果显示,与对照组相比,新功能型乳酸菌pp/NC8-goIFNα可以显著降低GPV的DNA基因表达量,提升雏鹅脾脏中IFNα和IFN-β基因表达水平,由此上调各种抗病毒细胞因子如MX、OAS、PKR等。通过肝脏、心脏、脾脏和小肠的组织病理切片可观察到,GPV组雏鹅组织病理学变化最严重,pp-goIFNα/NC8+GPV组、GPV+pp-goIFNα/NC8组以及IgY组雏鹅未见明显组织病理学变化。综上所述,本实验成功制备鼠抗goIFNα血清,成功构建新功能型乳酸菌pp-goIFNα/NC8,并成功将goIFNα蛋白锚定在乳酸菌表面,结果显示新功能型乳酸菌能够降低组织病理损伤和炎性病变,降低体内病毒的复制,增加了机体的抗病毒效果,为研制治疗小鹅瘟病的生物制品具有重要意义。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S858.33
【部分图文】：

图 1.1 goIFN-α 基因 PCR 扩增M. DL-2 000 Marker. 1. PCR 扩sult of PCR amplification produc2 000 Marker. 1.Amplification p50007505002501002000150010003000M 1bp

8-a-IFNα 的构建图 1.2 克隆质粒 pMD19T-goIFN-α L-5 000 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ enzyme digestion analysis of the clon0 Marker. 1,2. NdeⅠ+ XhoⅠ double dig

白的 Western-blot 分析图 1.4 goIFN-α 蛋白的 Western-blot 检测M. 蛋白质 Marker. 1. pET28-a/BL21 对照. 2-9.蛋白 goIFN-αFig.1.4 Western-blot analysis of goIFN-α proteinM. Protein Marker. 1. pET28-a/BL21 control. 2-9. goIFN-α protein0

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本文编号：2814621