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菟丝子黄酮对双酚A致小鼠睾丸间质细胞凋亡的缓解作用

发布时间:2020-09-09 15:41
   双酚A(Bisphenol A,BPA)属于环境干扰物,作为增塑剂被应用于初生儿使用的一切塑料制品及各种食品内涂层。因为BPA的化学结构与雌激素类似,因此具有抗雄激素的活性。菟丝子黄酮作为传统补肾中药菟丝子的主要有效成分,不仅具有免疫调节和抗氧化的作用,而且还能改善生殖器官的功能。本试验通过观察菟丝子黄酮对双酚A致小鼠睾丸间质细胞凋亡的缓解作用,阐述菟丝子黄酮缓解BPA生殖毒性的作用机制。体内试验:将60只昆明雄性小鼠随机均分为5组,即阴性对照组,BPA模型组和菟丝子黄酮低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(30 mg/kg)剂量保护组。模型组每天灌服20mg/kg的BPA,保护组同时灌服相应剂量的菟丝子黄酮和BP A(20mg/kg),1次/d,连用7 d,7 d末眼球采血,处死。分离血样,放免法检测血清中睾酮和促黄体生成素的含量,同时制作睾丸切片、光镜检测精子活力、睾丸间质细胞染色定位及纯度分析。TUNEL法检测凋亡小体的数量,Real-Time Q PCR检测睾丸组织中间质细胞中MAPK通路上ERK、P38和JNK的转录水平,Western Blotting检测MAPK通路蛋白磷酸化的表达。结果发现,与阴性对照组相比,20mg/kg的BPA可极显著降低小鼠血清中睾酮和黄体生成素含量(P0.01);与模型组相比,10、20、30 mg/kg的菟丝子黄酮组能极显著提高血清中黄体生成素的含量(P0.01);30 mg/kg的菟丝子黄酮能极显著提高血清中睾酮的含量(P0.01)。与空白对照组相比,模型组的ERK的mRNA的表达量显著降低(P0.05),P38和JNK的mRNA表达量显著上调(P0.05);与模型组相比,10、20、30 mg/kg的菟丝子黄酮组显著上调了ERK的mRNA的表达量(P0.05),P38和JNK的mRNA表达量显著下调(P0.05)。与阴性对照组相比,模型组中睾丸间质细胞数量以及精子的数量显著减少(P0.05);与模型组相比,10、20、30 mg/kg的菟丝子黄酮组的睾丸间质细胞数量以及精子的数量显著增加(P0.05)。精子畸形率会随菟丝子黄酮的浓度的升高而显著降低(P0.05)。TUNEL法检测模型组睾丸间质细胞的凋亡数量显著高于阴性对照组(P0.05)。与阴性对照组相比,BPA模型组的睾丸间质细胞ERK蛋白磷酸化极显著降低(P0.01);P38和JNK蛋白磷酸化极显著增加(P0.01);与模型组相比,各个剂量组的菟丝子黄酮能极显著提高睾丸间质细胞ERK蛋白磷酸化的表达(P0.01),同时抑制JNK和P-38蛋白磷酸化的表达(P0.01)。高、中、低剂量的菟丝子黄酮均可显著缓解上述指标的异常(P0.05或P0.01),且缓解作用与浓度呈正相关。体外试验:以生长状态良好,且处于对数生长期的小鼠睾丸间质细胞为对象,利用MTT法筛选确定BPA对小鼠睾丸间质细胞的最适染毒剂量和菟丝子黄酮对该细胞的安全剂量范围。本试验中用一定剂量的菟丝子黄酮预处理细胞4 h,BPA染毒细胞24 h后,通过放免法检测细胞睾酮和促黄体生成素的分泌量,TU NEL法检测凋亡小体的数量,Real-time PCR检测BPA诱导的小鼠睾丸间质细胞中MAPK通路上的ERK、P38和JNK的转录水平。Western Blotting检测MAPK(丝裂原蛋白激酶)通路蛋白磷酸化的表达。结果显示,与空白对照组相比,80μmoL/mL的BPA显著降低睾丸间质细胞分泌睾酮和促黄体生成素的分泌量(P0.05)。与模型组相比,250、300、350、400μg/mL的菟丝子黄酮组显著提高睾酮和黄体生成素的含量(P0.05)。TUNEL法检测到模型组的凋亡小体的数量显著高于空白对照组(P0.05);与模型组相比,不同浓度的菟丝子黄酮均能显著减少凋亡小体的数量(P0.05)。与空白对照组相比,模型组的ERK的mR NA的表达量显著降低(P0.05),P38和JNK的mRNA表达量显著上调(P0.05);与模型组相比,250、300、350、400μg/mL的菟丝子黄酮组显著上调了E RK的mRNA的表达量(P0.05),P38和JNK的mRNA表达量显著下调(P0.05)。与空白对照组相比,BPA模型组的睾丸间质细胞ERK蛋白磷酸化极显著降低(P0.01);P38和JNK蛋白磷酸化极显著增加(P0.01);与模型组相比,菟丝子黄酮能极显著提高睾丸间质细胞ERK蛋白磷酸化的表达(P0.01),同时抑制JNK和P-38蛋白磷酸化的表达(P0.01)。250、300、350、400μg/mL的菟丝子黄酮均可显著缓解上述指标的异常(P0.05或P0.01),且缓解作用与浓度呈正相关。综上所述,菟丝子黄酮可以通过MAPK通路缓解BPA加速睾丸间质细胞凋亡,减少BPA对睾丸间质细胞的损伤,缓解激素的分泌异常。
【学位单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2019
【中图分类】:S859.8
【部分图文】:

均匀分布,组织病理,生精细胞,管腔


3 结果3.1 菟丝子黄酮对 BPA 致小鼠睾丸组织病理学变化的影响光镜下观察结果显示,对照组小鼠睾丸曲精细管细胞排列整齐,横断面呈圆形或椭圆形,各级生精细胞按次序排列在管壁上,结构清晰,管腔内可见大量的未成熟各级细胞,间质细胞均匀的分布在基膜外,排列整齐(图 A)。20 mg/kg BPA 染毒组,部分生精小管萎缩,各级生精细胞排列紊乱、脱落,生精细胞层减少,管腔间隙变大,精子数量明显减少,睾丸间质细胞较对照组明显减少(图 B)。10 mg/kg 菟丝子黄酮剂量保护组,生精细胞层对比 BPA 组,开始增多,管腔间隙无明显变化,生精细胞排列较规律,精子细胞无明显变化,睾丸间质细胞分布较为均匀(图 C),20 mg/kg菟丝子黄酮剂量保护组,生精小管逐渐恢复,生精细胞排列比较规律,无明显脱落,管腔间隙变小,精子细胞明显增多,睾丸间质细胞分布较为均匀(图 D),30 mg/kg菟丝子黄酮剂量保护组对比 BPA 组,生精小管趋于对照组,生精细胞排列规律排列在管壁上,层次清晰,管腔内可见大量的未成熟的精子细胞,间质细胞均匀分布在基膜外。见图 1

双酚


图 2 菟丝子黄酮对 BPA 染毒小鼠精子畸形率的影响Fig. 2 Effect of Cuscuta chinensis flavonoids on the deformity rate of mice induced by BPA注:A:空白对照组 B:双酚 A 模型组 C:10mg/kg 菟丝子黄酮组 D: 20mg/kg 菟丝子黄酮组 E: 30mg/kg 菟丝子黄酮组Note: A: Blank control group B: BPA Model group C:10mg/kg Cuscuta chinensis flavonoids group D:20mg/kg Cuscuta chinensis flavonoidsgroup E:30mg/kg Cuscuta chinensis flavonoids GroupA B C D E050100150*组组精精精

间质细胞,双酚,凋亡,空白


空白组 12 15.12±0.43C0.06±0.02BBPA 组 12 12.43±0.44A0.03±0.01A10mg/kg 菟丝子黄酮组 12 13.62±0.46B0.03±0.01A20mg/kg 菟丝子黄酮组 12 14.9±0.49BC0.04±0.03AB30mg/kg 菟丝子黄酮组 12 15.56±0.21C0.06±0.01B注:含不同大写字母表示差异极显著(p<0.01)Note: The different uppercase letters indicate that the difference is extremely significant (p<0.01)3.5 菟丝子黄酮对 BPA 染毒小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响如图 4、图 5 所示,由小鼠睾丸中提取的睾丸间质细胞经 TUNEL 法检测凋亡,检测到呈绿色荧光的凋亡细胞,且阳性染色明亮,各组之间整体比较具有显著差异(P<0.05),其中以双酚 A 组细胞凋亡率最高,其次是 10 mg/kg 菟丝子黄酮保护组、20mg/kg 菟丝子黄酮保护组、30 mg/mL 菟丝子黄酮保护组,空白组最低。菟丝子黄酮能调节双酚 A 对间质细胞凋亡,起到减轻双酚 A 毒性的作用。基于样本数量较少及作用时间单一,药物对细胞凋亡的影响需要进一步研究。

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本文编号:2815162

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