INH和AMH对小鼠卵泡发育的协同调控作用及机制研究

发布时间：2020-09-10 11:20

　　在雌性动物中,抗缪勒氏管激素(Anti-Mullerian Hormone,AMH)主要由腔前卵泡及小有腔卵泡分泌,能抑制原始卵泡的募集以及初级卵泡向有腔卵泡的转换。抑制素(Inhibin,INH)主要由大有腔卵泡分泌,其对有腔卵泡的发育以及成熟具有抑制作用。AMH和INH同属于转化生长因子β(TGF-β)超家族成员,且两者都对卵泡发育具有负调控作用,然而两者间是否存在相互作用或协同作用尚不明晰。因此,本研究一方面从细胞水平分析AMH与抑制素A(Inhibin A,INHA)对小鼠颗粒细胞类固醇激素分泌的调控作用与机制,另一方面利用基因免疫技术从活体水平探讨了AMH与INH联合免疫对小鼠血浆类固醇激素含量、卵巢重量及产仔数的影响。旨在阐明AMH与INH两者在卵泡发育过程中的相互作用,本研究不仅有助于丰富动物繁殖内分泌理论,同时为开发提高动物繁殖力的新技术奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.AMH和INHA单独处理对颗粒细胞类固醇激素合成与分泌的调控作用分别将不同浓度(1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL)AMH或INHA在基础水平或FSH诱导水平处理小鼠颗粒细胞48 h,利用ELISA法检测颗粒细胞上清液中雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的分泌水平。结果发现,单独添加AMH对基础水平E_2和P_4的生成无显著影响;INHA对基础水平E_2的生成也没有显著影响,但低剂量(1ng/mL)和中剂量(10 ng/mL)INHA处理组对基础水平孕酮的生成有显著抑制作用(P0.05);值得注意地是,AMH和INHA均能极显著抑制FSH诱导水平下E_2和P_4的合成(P0.01)。采用Real-time PCR法检测颗粒细胞芳香化酶相关基因的表达,发现AMH和INHA均不改变基础水平下CYP19A1、FSHR、P450scc、3βHSD和StAR mRNA的表达,但均能极显著抑制FSH诱导水平下CYP19A1、FSHR、P450scc、3βHSD和StAR mRNA的表达(P0.01)。2.AMH和INHA联合处理对颗粒细胞类固醇激素合成与分泌的调控作用与机制研究将AMH和INHA联合添加于小鼠颗粒细胞48 h后,检测上清中雌二醇(E_2)和孕酮(P_4)的分泌。结果发现,与AMH或INHA的单独添加组相比,AMH和INHA联合添加能极显著抑制FSH诱导的颗粒细胞中E_2的分泌(P0.01);此外,AMH和INHA联合添加对FSH诱导孕酮分泌的抑制作用极显著强于AMH单独添加组(P0.01),显著强于INHA单独添加组(P0.05),提示AMH与INHA可协同负调控FSH诱导水平下雌激素和孕酮的分泌。此外,AMH和INHA均能显著抑制FSH诱导的胞内cAMP水平(P0.05)以及CREB磷酸化;FSH还能诱导INH-Activin竞争系统下游Smad2/3的磷酸化(P0.01),而INHA则能抑制FSH介导的pSmad2/3信号通路(P0.05)。结果提示,AMH和INH主要通过抑制FSH介导的cAMP-PKA-CREB信号通路而发挥其对类固醇激素的负调控作用;INH还可通过抑制Smad2/3信号通路抑制类固醇激素的生成。3.AMH和INH联合免疫对小鼠繁殖力的影响选取120只体重相近的5周龄昆明雌鼠,随机分为4组,分别单独肌肉注射pVAX-tPA-SAMH-asd(A组)与pVAX-tPA-SINH-asd(I组)质粒以及联合注射pVAX-tPA-SAMH-asd和pVAX-tPA-SINH-asd质粒(AI组),生理盐水作为对照组(C组),间隔2周后相同剂量加强免疫1次。结果表明,不同质粒免疫组均能诱导小鼠产生针对AMH或(和)INH特异性免疫反应,且具有很高的抗体阳性率和抗体滴度;其中,INH抗体阳性鼠与AMH和INH双抗体阳性鼠血浆中雌二醇水平以及卵巢重量均显著高于对照组(P0.05);AMH抗体阳性鼠产仔数显著高于抗体阴性鼠(14.88±2.16 VS.13.43±2.28,P0.05),AMH和INH双抗体阳性鼠的产仔数极显著(15.61±1.79 VS.13.43±2.28,P0.01)高于阴性鼠。此外,研究发现疫苗免疫后不会影响小鼠的体增重和脏器指数。综上所述,AMH与INHA能协同抑制颗粒细胞类固醇激素的合成与分泌,AMH与INHA联合基因免疫能显著提高小鼠繁殖力。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S814
【部分图文】：

因子,激活素,抑制素,亚基

图 1-1 不同激素和因子在卵泡生长中的作用（改自 Hillier 2009 和 Visser 2006）Fig. 1-1 The role of different hormones and factors in follicular growth (changed from Hillier2009 and Visser 2006)1.3 INH 的生物学特性与功能1.3.1 INH 的结构与表达INH 属于 TGF-β 超家族，是由两个亚基组成的 32 kDa 的异源二聚体糖蛋白，α-亚基（18 kDa）和 β-亚基（14 kDa）βA 或 βB 形成抑制素 A（α-βA）和抑制素 B（α-βB）(Ardekani et al 1998, Geng et al 2008, Ling et al 1986, Mason et al 1985)。由两个 β-亚基组成的 24 kDa 同源二聚体，形成激活素 A（βA-βA），激活素 B（βB-βB）和激活素 AB（βA-βB）(Ling et al 1986, M’Baye et al 2015)，如图 1-2 所示。INH α、βA、βB 亚基 mRNA 在绵羊的大优势卵泡中的表达显著高于小卵泡(Campbell and Baird 2001)；猪大卵泡中卵母细胞 INH βA 和 βB 亚基蛋白表达量也显

分子结构图,分子结构,雄激素,抑制素

图1-2 Inhibin和Activin的基本分子结构（Knight 2001）g. 1-2 The basic molecular structure of Inhibin and Activin (Knight 2类固醇生成强 LH 对睾丸间质细胞雄激素生物合成的刺激作用，但 Actsueh AJ et al 1987)；其可作用于人卵巢鞘样肿瘤细胞，提高和雄激素合成(Sawetawan C et al 1996)，同时也能消除了激中 StAR 和 3β-HSD 表达及雄激素生成的抑制作用(Young an无论在活体水平还是细胞水平，抑制素在颗粒细胞类固醇生可：已经报道了抑制素对大鼠颗粒细胞 FSH 诱导的雌二醇产009, Ying SY et al 1986)；用 Inhibin α 抗体处理后，也显著增分泌和细胞增殖(Cai et al 2015)；而与之相反的是，体内免疫ibin 导致雌二醇分泌显著降低，孕酮水平显著升高，当提供

质粒图谱,真核表达质粒,中农,颗粒细胞

中农业大学 2019 届硕士研究生学位（毕业）论文sd 真核表达质粒由王亚平构建与保存（王AX-tPA-SAMH-asd 真核表达质粒由姜婷图 2-2 所示；小鼠原代颗粒细胞取自 21

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