狐源致病性大肠杆菌HtrA蛋白的免疫保护力及功能研究

发布时间：2020-09-11 19:12

　　为研制更加安全高效的大肠杆菌疫苗,本研究以狐源致病性肺炎大肠杆菌HtrA蛋白为研究对象,克隆htra基因序列,构建原核表达载体,诱导表达重组蛋白His-HtrA,镍柱纯化重组蛋白,并检测其免疫保护力;利用Red同源重组技术成功构建大肠杆菌htra基因缺失株,研究htra基因与细菌生物学特性以及致病力之间的关系,为研究HtrA蛋白的致病机制和大肠杆菌基因工程疫苗提供参考。研究的具体内容与结果包括:1.大肠杆菌HtrA蛋白的原核表达及免疫保护力分析本研究根据NCBI GeneBank中公布的htra基因序列,设计引物克隆出大肠杆菌htra基因;构建pET-32a-htra表达载体,将重组载体转化入BL21大肠杆菌工程菌中,成功表达目的重组蛋白,大小约为65 kD,Western blot方法证明该蛋白具有较好的免疫原性。将纯化蛋白免疫小鼠,以2LD_(50)剂量的野生大肠杆菌攻毒,HtrA蛋白对小鼠的免疫保护力达到65%,结果表明HtrA蛋白具有作为疫苗的潜力。2.大肠杆菌htra基因缺失株的构建和基本特性研究为探究htra基因在大肠杆菌中的作用,利用Red同源重组技术构建htra基因缺失株,研究发现,大肠杆菌野生型和htra基因缺失株在生长速率和生化特性方面并没有明显差异。3.大肠杆菌htra基因缺失株生物学特性分析及毒力试验本研究从细菌运动能力、生物被膜形成能力、抗巨噬细胞吞噬能力、抵抗环境应激能力以及毒力等几方面对突变菌株进行评价,结果表明,htra基因缺失株的运动能力、生物被膜形成能力、抗吞噬细胞吞噬能力以及抵抗环境应激能力均有明显下降。检测htra基因缺失株的LD_(50),结果显示缺失株的LD_(50)=3.55×10~7CFU,野生型大肠杆菌的LD_(50)=5.01×10~6 CFU,相差7倍,且缺失株引起的组织损伤较弱,说明htra基因缺失能够影响大肠杆菌毒力。
【学位单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S852.61
【部分图文】：

同源性分析,结构域,残基,氨基酸残基

桶被称为 LA（含 34~41 个氨基酸残基），LB (59~64)，LC (91~102)，1（184~189），L2（214~228），L3（164~181) 。HtrA 蛋白属与 SA 家白酶，其水解域至少与一个 C-末端的 PDZ 结构域结合，含有 350~450残基（图 1-2）。

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其水解域至少与一个 C-末端的 PDZ 结构域结合，含有 350~4残基（图 1-2）。图 1-1 HtrA 家族成员同源性分析Fig 1-1 Analysis of the homology of HtrA family members

结构域

蛋白 N-端具有调控功能的模块结构，一个是保守的胰蛋白酶样蛋 PZD 结构域（图 1-3），一般具有“开放”和“封闭”两种状态，模块调节特异性蛋白之间的相互作用，优先结合到目标蛋白的基上[51,52]。HtrA 蛋白的 PDZ 结构域能形成类似环状二级结构肽在 N-端和 C-端实现链的交换。

【参考文献】