重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的评价

发布时间：2020-09-11 17:52

　　重楼皂苷Ⅰ(polyphyllinⅠ,PPⅠ)是从中药重楼中提取的一种小分子单体,属于甾体皂苷。PPⅠ作为一种毒副作用小且具有强烈抗肿瘤效应的小分子物质,已经被报道能影响多种肿瘤细胞和移植瘤的生长。肝癌在世界常见恶性肿瘤中位列第五,患者生存期短。近些年来,世界各地肝癌患者人数剧增,该病已成为威胁人类健康的重大疾病之一。经前期研究发现,重楼皂苷Ⅰ能够促进肝癌细胞的死亡并诱导其凋亡,线粒体通路的激活是其诱导肝癌细胞凋亡的主要机制,但是内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)和死亡受体(death receptor,DR)信号通路在这一过程中的作用还未见报道。因此本研究应用CCK-8法、Hochst33258染色、qRT-PCR(real-time quantitative PCR)、免疫印迹(Western blot,WB)等技术和方法,从表观水平、基因水平和蛋白水平深入研究内质网应激和死亡受体通路在PPⅠ诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用,为寻找重楼皂苷Ⅰ诱导肝癌HepG2细胞凋亡的效应蛋白提供研究方向及理论基础,并在此基础上进行新的治疗靶点的开发。主要研究内容及结果如下:1.重楼皂苷Ⅰ对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响重楼皂苷Ⅰ对HepG2细胞存活率和细胞核形态学的影响采用CCK-8法和Hoechst33258染色法进行检测;免疫印迹法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3、Bax和Bcl-2的变化水平。试验表明:(1)重楼皂苷Ⅰ呈时间浓度依赖的方式抑制HepG2细胞的存活率。PPⅠ刺激HepG2细胞6、12和24 h的ⅠC50分别为4.4±0.5μmol/L、2.5±0.1μmol/L和2.3±0.2μmol/L。(2)重楼皂苷Ⅰ刺激HepG2细胞12 h后,经Hoechst33258染色及荧光显微镜可观察到细胞呈现出典型的凋亡细胞形态,细胞体积缩小、核固缩,细胞核内可见浓染的蓝色颗粒状强荧光,且细胞内的浓染颗粒与重楼皂苷Ⅰ的使用浓度呈正比关系。(3)免疫印迹检测发现促凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3和Bax表达显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2显著下调。以上结果表明,重楼皂苷Ⅰ抑制HepG2细胞增殖的机制是通过诱导细胞凋亡。2.重楼皂苷Ⅰ对HepG2细胞内质网应激通路的影响为了进一步研究重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的机制是否与内质网应激信号通路相关,采用qRT-PCR法检测HepG2细胞中GRP78、ATF-6、PERK、ⅠRE-1和CHOP mRNA的表达情况;免疫印迹法检测内质网应激相关蛋白Cleaved-caspase12、Caspase-12、ⅠRE-1和CHOP的变化;随后用20 mmol/L内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-pHenyl butyric acid,4-PBA)预处理HepG2细胞2 h,检测ⅠRE-1蛋白表达水平、细胞核形态学及细胞凋亡率的变化,确定内质网应激在PPⅠ诱导HepG2细胞凋亡中的作用。结果显示:(1)内质网应激通路相关基因中,ATF-6和PERK mRNA水平无明显变化,GRP78和ⅠRE-1 mRNA水平均显著升高,提示重楼皂苷Ⅰ可能特异性的激活了ⅠRE-1通路;在蛋白水平发现PPⅠ可活化内质网应激的标志蛋白Caspase-12,同时ⅠRE-1蛋白显著增加。(2)内质网应激通路下游重要的促凋亡因子CHOP在mRNA水平和蛋白水平均无明显变化。(3)4-PBA预处理HepG2细胞2 h后,细胞内ⅠRE-1蛋白表达水平显著下调,提示4-PBA有效的抑制了内质网应激;在内质网应激被抑制后,HepG2细胞中浓染的细胞核及细胞凋亡率均显著增加。以上结果提示,内质网应激在重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的过程中被激活,但其在该过程中并没有发挥促凋亡作用,而是细胞的一种自我保护反应。3.重楼皂苷Ⅰ对HepG2细胞死亡受体通路的影响为了进一步研究重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的机制是否与死亡受体信号通路相关,采用qRT-PCR法检测HepG2细胞中死亡受体通路相关基因Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA水平的变化;免疫印迹法检测死亡受体通路相关蛋白Cleaved-caspase8、FADD、Fas和TNF-α的变化;随后用Caspase-8抑制剂Z-ⅠETD-FMK及坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)预处理细胞2 h,检测细胞存活率以及坏死性凋亡蛋白RⅠPK1和RⅠPK3的变化,确定死亡受体通路在PPⅠ诱导HepG2细胞凋亡中的作用,以及验证Caspase-8的抑制是否激活了HepG2细胞的坏死性凋亡。结果显示:(1)死亡受体通路相关基因中,Fas、FasL、TNFR1和TNF-αmRNA水平均显著增加,提示死亡受体通路可能被激活;接下来在蛋白水平发现PPⅠ可活化死亡受体通路的标志蛋白Caspase-8,同时FADD、Fas和TNF-α蛋白均显著增加,该结果验证了qRT-PCR结果。(2)Z-ⅠETD-FMK预处理2 h后,观察到HepG2细胞皱缩明显,细胞数量也明显减少,且坏死性凋亡相关蛋白RⅠPK1和RⅠPK3大量表达,但在各组间无显著性变化。提示Caspase-8的抑制,可能激活了细胞内的另一条不依赖Caspase的凋亡途径即坏死性凋亡途径继续诱导HepG2细胞凋亡。(3)Z-ⅠETD-FMK联合Nec-1预处理细胞2 h后,细胞存活率较Z-ⅠETD-FMK单独预处理组显著升高,该结果验证了HepG2细胞中坏死性凋亡的发生。以上研究表明,死亡受体通路在在重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的过程中被激活,且发挥促凋亡的作用,但当其被抑制时,可诱导HepG2细胞发生坏死性凋亡,加强细胞死亡。综上所述,内质网应激和死亡受体信号通路在重楼皂苷Ⅰ诱导HepG2细胞凋亡的过程中均被激活,但该过程激活的是内质网应激适应性系统,抑制了HepG2细胞凋亡,从而促进细胞存活,说明内质网应激对HepG2细胞的死亡具有负向调控作用,这提示我们在临床治疗时将重楼皂苷Ⅰ和抑制剂联合应用有望提高癌细胞的死亡,从而达到最终清除癌细胞的目的;此外,死亡受体信号通路的抑制可诱导HepG2细胞发生坏死性凋亡,进一步促进细胞凋亡,从而加强细胞死亡,说明重楼皂苷Ⅰ不仅可以诱导细胞凋亡,而且具有诱导坏死性凋亡的效应,提示重楼皂苷Ⅰ有望成为一种有效的抗癌药物应用于临床。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S853.74
【部分图文】：

分子结构图,重楼,皂苷,分子结构

图 1-1 重楼皂苷的分子结构Fig. 1-1 The structure of the polyphyllins注：A：重楼皂苷Ⅰ；B：重楼皂苷Ⅱ；C：重楼皂苷Ⅵ；D：重楼皂苷Ⅶ。Note: A: polyphyllin Ⅰ; B: polyphyllin Ⅱ; C: polyphyllin Ⅵ; D: polyphyllin Ⅶ楼皂苷的抗肿瘤活性楼皂苷具有广泛的生物学效应，其作为云南白药、宫血宁等中成药应用于临床多年[14]。近年来，重楼皂苷的抗肿瘤作用备受关注，作药，已用于多种癌症的治疗，为治疗癌症提供了新的策略。重楼皂开发治疗癌症的药物多为中药组方，包括益肺抗瘤饮、清毒饮、抗煎剂等。虽然作用机理不同，但均有良好的抗癌效果，在临床治疗。机体外周血中 NK 细胞，抗原 CD3 和 CD4 的抗体与机体的免疫高他们的活性或含量，便能提高机体免疫力，调动患者本身的抗肿

直方图,细胞存活率,皂苷,重楼

< 0.05 表示差异有统计学意义。本研究直方图采用 GraphPad 果苷 I 对肝癌 HepG2 细胞存活率及凋亡的影响皂苷 I 对肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制作用度重楼皂苷 I 分别处理 HepG2 细胞 6、12 和 24 h，采用 C。结果显示，重楼皂苷 I 处理可以不同程度的抑制 HepG2 细的时间和剂量依赖性。根据 GrapHpad prism 5 软件计算出重胞 6、12 和 24 h 的 IC50分别为 4.4 ±0.5 μmol/L、2.5 ±0.1 μ（图 3-1）。基于以上结果, 本研究选择 2.5 μmol/L 和 12 h 作苷 I 的作用浓度和时间。

重楼,皂苷,HepG2细胞

18图 3-2 重楼皂苷Ⅰ对 HepG2 细胞形态学的影响Fig. 3-2 The effect of PPI on morpHology of HepG2 cells3.1.2 重楼皂苷 I 对 HepG2 细胞核形态的影响为明确重楼皂苷 I 诱导 HepG2 细胞死亡的类型，试验采用 Hoechst 33258 对细胞进行染色，在荧光显微镜下观察结果。重楼皂苷 I （1、2、3、4 和 5 μmol/L）作用 12 h 后可见 HepG2 细胞表现出典型的凋亡细胞形态，其中细胞核被着色为蓝色强荧光是最重要的标志，且浓染的细胞数及荧光强度与重楼皂苷 I 的使用浓度呈正比关系。而阴性对照组细胞未见明显的核固缩或浓染现象，细胞着色为弥散性均匀荧光，且荧光强度较弱。参照文献[92]随机计数 5 个视野中的致密浓染细胞数，计算细胞凋亡率。阴性对照组和试验组的凋亡率分别是：3.0%（0 μmol/L）、7.3%（1μmol/L）、13.3%（2 μmol/L）、15.2%（3 μmol/L）、23.7%（4 μmol/L）和 61.6%（5 μmol/L），随着处理浓度的升高，试验组凋亡率显著性上调（P < 0.01, 图 3-3）。

【相似文献】